褪黑素對干旱脅迫下大豆產量及AsA-GSH循環的影響

杜 昕 李 博 毛魯梟 陳 偉 張玉先 曹 亮

（黑龍江八一農墾大學農學院，163319，黑龍江大慶）

鼓粒期是決定大豆豐收與否的關鍵時期，大豆遭遇干旱脅迫后自身抗氧化防御機制會被啟動，產生緩解氧化脅迫的保護物質[1]，但長時間的干旱脅迫會導致植株體內活性氧（ROS）激增，進而破壞植株體內原有的代謝平衡[2]，造成植株細胞膜過氧化[3]、蛋白質失活、組織機能受損[4]和抗壞血酸－谷胱甘肽（AsA-GSH）循環受阻[5]，影響鼓粒期籽粒建成，造成產量大幅度下降。因此如何在干旱脅迫下維持大豆AsA-GSH循環的正常運轉和抑制ROS產生，對大豆鼓粒期生長發育具有重要意義。

植物生長調節劑是增強植株抗旱能力的輔助方法之一[6]。褪黑素（melatonin，MT）化學名為N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一類廣泛存在于動植物體內的重要吲哚類激素[7]。有研究[7]發現，褪黑素可緩解干旱脅迫對植物膜系統的損傷，還可促進干旱脅迫下植物葉片中還原型抗壞血酸（AsA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量增加。研究[8]表明，褪黑素可在干旱脅迫下幫助植物穩定AsA-GSH循環，這是植物體內重要的抗氧化防御機制，同時增強 AsAGSH循環清除ROS的能力[9]，AsA-GSH循環中重要的抗氧化物質AsA和GSH是植物體中為數不多的既可以直接還原 ROS，又可以作為酶底物清除ROS的抗氧化物質[10]，在經過褪黑素處理后二者含量均有顯著提升。

近年來有關褪黑素的相關研究逐漸增多，但關于褪黑素對干旱脅迫下大豆AsA-GSH循環影響的研究還鮮有報道。因此本試驗探究褪黑素處理下大豆AsA-GSH循環的變化與特征，為利用褪黑素抵抗逆境的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

以干旱敏感型大豆品種綏農 26為供試品種，盆栽桶直徑 30.0cm、高 33.0cm。為了有效控制土壤含水量和避免土壤板結，采用蛭石、珍珠巖和黑鈣土體積比1:3:12混合作為基質。混合培養土理化性質：有機質3.9mg/kg、堿解氮72.1mg/kg、速效磷14.1mg/kg、速效鉀173.0mg/kg、pH 7.1。施肥量按照大田磷酸二銨300kg/hm2、尿素75kg/hm2和硫酸鉀75kg/hm2進行折算施用。播種前測量每盆基質質量和含水量，計算出基質干重。通過環刀法測量最大持水量，以便后續控水過程中準確掌握田間持水量。

試驗于2020年在黑龍江省大慶市國家雜糧工程技術研究中心進行。為了避免雨水淋澆，所有盆栽均放置在遮雨棚中。大豆種子采用75%的酒精處理2min，再用5% NaClO消毒5min，用無菌水洗凈后播種。每盆播種 6粒，均勻排布。在子葉期（VC）定苗3株，去除過大或過小的幼苗，保留長勢均勻適中的幼苗。

自播種至鼓粒始期，采用稱重法控制土壤含水量為田間持水量的80%。試驗設正常供水（CK）、干旱（D）和干旱脅迫噴施褪黑素（D+M）3個處理，每個處理100盆。正常供水處理（CK）：保持土壤含水量為田間持水量的 80%；干旱脅迫處理（D）：停止供水并于每天18:00稱重，土壤含水量達到田間持水量的50%為止，之后補水維持此含水量，第 3次取樣結束后恢復供水至田間持水量的80%，直至收獲；干旱脅迫噴施褪黑素處理（D+M）：土壤含水量達到田間持水量的50%后，連續3d在21:00噴施濃度100μmol/L的褪黑素。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 植株形態指標及其干、鮮重 將植株取出后洗凈，將地上部和地下部分開，測量株高、根長、莖粗和根體積等形態指標。

1.2.2 超氧陰離子（O2-.）和H2O2含量 采用羥胺氧化法[11-13]測定O2-.含量。采用碘化鉀法[14]測定H2O2含量。

1.2.3 AsA-GSH循環指標 參照Cakmak等[15]的方法采用過氧化氫法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性。

參照Grill[16]的方法測定谷胱甘肽還原酶（GR）活性；根據Griffith[17]的方法測定抗壞血酸（AsA）含量；參照Rao等[18]方法測定GSH含量；參照李進等[10]方法測定氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量和氧化型抗壞血酸（DHA）含量。

1.2.4 取樣時間及方法 用于生理指標和干物質測定的樣品分別在鼓粒初期褪黑素處理后的第5、10、15天取樣；用于酶活性等其他生理指標測定的樣品用液氮冷凍并快速轉移至-80℃冰箱保存待測。

1.3 數據處理

用SPSS軟件的Duncan’s多重比對法進行統計分析，用Origin軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對干旱脅迫下大豆ROS副產物的影響

由圖1可知，O2-.和H2O2含量隨著干旱脅迫時間的延長逐漸提高，與CK處理相比，在處理后15d，D處理O2-.和H2O2含量顯著提高，且在15d達到最大值，分別提高了98.43%和95.05%；與D處理相比，D+M處理O2-.含量在5、10和15d時分別下降了7.67%、15.37%和18.09%，H2O2含量分別下降了18.30%、21.71%和17.73%，在15d時3個處理間達到差異顯著水平。

圖1 褪黑素對干旱脅迫下大豆ROS副產物的影響Fig.1 Effects of melatonin on ROS by-products of soybean under drought stress

2.2 褪黑素對干旱脅迫下大豆AsA-GSH循環關鍵酶活性的影響

由圖2可知，與CK處理相比，D處理APX活性顯著上升，處理后5、10和15d，APX活性分別提高了33.11%、43.08%和41.59%；在處理后10d，D處理相比CK處理GR活性提高了64.63%，達到差異顯著水平。與D處理相比，D+M處理APX和GR活性顯著提高，D+M處理相比D處理的APX活性在第5、10和15d時分別提高了27.27%、28.13%和32.37%，GR活性分別提高了70.10%、14.50%和9.00%。

圖2 褪黑素對干旱脅迫下大豆AsA-GSH循環關鍵酶活性的影響Fig.2 Effects of melatonin on key enzymes activities of AsA-GSH cycle in soybean under drought stress

2.3 褪黑素對干旱脅迫下大豆AsA-GSH循環物質含量的影響

AsA、GSH、GSSG和DHA是植物AsA-GSH循環的主要成分，并且有調節AsA-GSH循環的重要功能。由圖3可知，與CK處理相比，D處理的AsA、GSH和GSSG含量顯著上升，處理后10d時上升幅度最大，分別為30.71%、32.70%和32.70%，DHA含量在處理后15d時達到差異顯著水平。與D處理相比，D+M處理進一步促進了AsA、GSH和 GSSG含量的提升，處理后 10d分別提高了22.39%、15.30%和 15.30%，達到差異顯著水平。DHA含量在處理后15d時達到差異顯著水平

圖3 褪黑素對干旱脅迫下大豆AsA-GSH循環物質含量的影響Fig.3 Effects of melatonin on AsA-GSH cycle substances contents in soybean under drought stress

2.4 褪黑素對干旱脅迫下大豆形態指標的影響

由表1可知，大豆鼓粒期遭遇干旱脅迫造成株高顯著降低，莖粗和底莢高有所下降。與CK處理相比，D處理的株高、莖粗和底莢高分別減少了4.61%、5.88%和10.26%。與D處理相比，D+M處理的株高、莖粗和底莢高分別提高了1.80%、2.06%和2.31%。

表1 褪黑素對干旱脅迫下大豆形態指標的影響Table 1 Effects of melatonin on morphological indexes of soybean under drought stress

2.5 褪黑素對干旱脅迫下大豆產量構成因素的影響

由表2可知，與CK處理相比，D處理的單株莢數、單株粒數、百粒重和單株粒重顯著下降，下降幅度分別為10.97%、7.11%、29.64%和33.75%。與D處理相比，D+M處理上述指標均顯著增加，分別增加了4.68%、4.18%、12.20%和9.20%。

表2 褪黑素對干旱脅迫下大豆產量構成因素的影響Table 2 Effects of melatonin on yield components of soybean under drought stress

3 討論

干旱脅迫會導致大豆鼓粒期的生長發育受阻，從而造成形態指標以及干物質累積量的降低[19]。本研究中，干旱脅迫導致大豆株高、莖粗和底莢高下降，而經過褪黑素處理后，株高、莖粗和底莢高顯著上升，說明褪黑素能有效緩解干旱脅迫對大豆植株形態發育的抑制。鼓粒期是大豆生殖生長的關鍵時期，此時期遭遇干旱脅迫會導致大豆產量降低[20]。研究[21]表明，褪黑素可通過提高抗氧化酶活性和抗氧化劑含量，進而減少植物體內ROS含量，減輕植物膜脂過氧化程度。H2O2和 O2-.是植物體內ROS的副產物，可在一定程度上體現植物體內ROS的富集程度，而干旱脅迫會抑制大豆的正常生長發育，破壞植物體內 ROS平衡的穩定狀態，造成活性氧物質大量外泄，過多的活性氧自由基不能被及時清除，會加快膜脂過氧化進程，降低膜系統的完整性，損傷蛋白質，最終導致植物體內生理生化代謝紊亂，抑制植物生長發育[22]。本研究發現，鼓粒期干旱脅迫導致大豆葉片中 O2-.和 H2O2含量顯著增加，與正常供水處理相比，干旱脅迫處理O2-.和H2O2含量顯著提高。研究[21]發現，褪黑素可提高大豆在逆境脅迫下的耐受性，原因可能是褪黑素可幫助大豆降低植物體內的活性氧自由基。本試驗研究表明，褪黑素可有效減少干旱脅迫下大豆葉片內O2-.和H2O2的積累，說明褪黑素對減少ROS副產物和穩定ROS平衡具有重要作用。

AsA-GSH循環是植物體內重要的抗氧化系統之一[23-24]，主要由抗氧化物質AsA和GSH與AsAGSH循環關鍵酶組成。研究[25]表明，植物體內AsA-GSH循環的快速運轉可減少植物體內活性氧自由基含量，保持ROS平衡，緩解植物過氧化進程。AsA-GSH循環中活性最強的酶是 APX和脫氫抗壞血酸還原酶，其活性的強弱直接影響AsAGSH循環清除ROS的效率[26]。APX是AsA-GSH循環中主要的清除酶[27]，而GSH的主要作用表現為促進膜蛋白結構穩定[28]，同時 GR活性可直接影響GSH含量[29]。本研究發現，干旱脅迫處理下ASA和GSH含量顯著上升，這說明大豆體內的氧化應激機制在起作用。葉面噴施褪黑素后，ASA、GSH、GSSG和GR的含量相比干旱脅迫處理均提高，這表明褪黑素可以快速激活AsA-GSH循環，提高關鍵酶活性，維持AsA-GSH循環的高速運轉并清除大豆體內的ROS副產物。王詩雅等[27]研究發現，逆境脅迫下，植物體內AsA、DHA和GSSG可保護細胞膜免受脅迫損傷。本試驗結果表明，干旱脅迫導致大豆葉片AsA、DHA和GSSG含量增加，褪黑素處理則進一步提高了 AsA、DHA和GSSG的含量，這與王詩雅等[27]的研究結果相同，說明褪黑素不但可以提升 AsA-GSH循環中清除機制的效率，還可以增強AsA-GSH循環中的保護機制。

4 結論

干旱脅迫導致大豆葉片產生大量ROS，細胞膜脂過氧化程度加劇，褪黑素可提高干旱脅迫下大豆葉片AsA和GSH含量，增強APX和GR活性，促進干旱脅迫下大豆體內AsA-GSH循環的運轉，減少干旱脅迫造成的膜脂過氧化損傷，進而提高大豆的抗旱性，減少干旱脅迫對產量的不利影響。