基于葉綠素熒光的小麥越冬期凍害評價

楊 程 杜思夢 張德奇 時艷華 李向東 邵運輝 方保停 王漢芳

（河南省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所/小麥國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮中部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中原地區(qū)作物栽培科學觀測實驗站/河南省小麥生物學重點實驗室，450000，河南鄭州）

小麥是我國第二大糧食作物，河南省小麥種植面積約占全國小麥種植面積的 1/5，產(chǎn)量約占全國小麥總產(chǎn)量的1/4[1]，因此，河南省小麥的穩(wěn)產(chǎn)和豐產(chǎn)對我國糧食安全具有重要意義。

小麥與水稻、玉米相比生育期更長，在黃淮海麥區(qū)從10月一直持續(xù)到次年6月。漫長的生育期也意味著遭受各種自然災害和逆境脅迫的機率增大，包括低溫凍害[2]、干旱[3]、陰雨寡照[4]、高溫[5]和干熱風[6]等，其中低溫凍害是危害最嚴重的自然災害之一，由于全球生態(tài)環(huán)境的破壞和氣候變暖加劇，近年來異常氣候頻發(fā)，小麥遭受低溫凍害的風險也逐漸增高[7]。低溫不僅能夠通過降低葉片實際光化學效率和光合速率，降低小麥干物質(zhì)積累，進一步導致產(chǎn)量下降[8-9]，而且也會直接影響小花分化過程而導致穗粒數(shù)降低，從而影響產(chǎn)量[10]。此外，低溫還可以通過氧化壓力抑制小麥幼根的生長并導致其死亡[11]。合適的抗寒性評價指標無論是對小麥低溫逆境生理研究還是對實際生產(chǎn)中小麥抗寒栽培管理和抗寒育種都十分重要。

目前，評價小麥低溫抗寒性的指標主要有以下幾種，形態(tài)學指標，通過田間自然低溫或者人工模擬低溫處理，調(diào)查小麥的存活率、死莖率或凍害等級等形態(tài)學指標來評價小麥抗寒性[2,12-14]；利用電導率結合Logist方程求拐點溫度，通過確定植物組織的低溫半致死溫度，評價小麥低溫抗寒性[14-17]；低溫脅迫下，通過測定可溶性糖、游離脯氨酸、膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）等的含量和抗氧化酶活性來鑒定小麥的抗寒性[18-20]。通過光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、胞間二氧化碳濃度和最大光化學效率（Fv/Fm）等生理指標反映品種抗寒性[21]。以上方法在小麥抗寒性研究中均有應用，調(diào)查形態(tài)學指標（如凍死率、死莖率）僅適用于極端低溫條件下，而測定電導率和酶活性等方法需要通過破壞性取樣來實現(xiàn)，雖然通過光合儀測定光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間二氧化碳濃度可以實現(xiàn)田間和室內(nèi)條件下的無損傷測定，但是在田間測定過程中需要晴天且無風等條件，所以在實際應用過程中均有一定的局限性。測定Fv/Fm來反映葉片抗寒性具備無損傷和快速高效等優(yōu)點，但是該指標的準確度和對低溫的敏感度等尚沒有充分的試驗驗證。

葉綠素熒光誘導動力學曲線蘊含著豐富的光合作用的相關信息，是無損測定葉片光合性能的常用手段。植物光合機構對逆境脅迫非常敏感，干旱[22]、低溫[23]、高溫[24]和鹽[25]等脅迫都會導致光合作用的下降和葉綠素熒光誘導曲線的改變。因此，本研究通過分析33個小麥品種越冬期凍害的形態(tài)指標與包括Fv/Fm在內(nèi)的 34個常用葉綠素熒光誘導動力學參數(shù)的相關性，驗證這些參數(shù)與小麥凍害的相關性并篩選能夠反映小麥凍害程度的更優(yōu)指標，為小麥越冬期田間管理和抗寒育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料種植和田間管理

選用1941-2014年通過審定的33個冬小麥品種（表1）種植于河南省平原新區(qū)（新鄉(xiāng)市原陽縣）河南省農(nóng)業(yè)科學院實驗基地，小區(qū)面積6m2，試驗田塊肥力較高，地力均勻度好，按照大田生產(chǎn)實際整地，2016年 10月 5日播種，株距 2cm，行距20cm，通過人工點播保證均勻度一致，通過合理水肥管理保證整個生育期水肥充足。

表1 供試小麥品種Table 1 The wheat varieties tested

1.2 越冬期小麥生長指標和凍害情況調(diào)查

指標調(diào)查時間為2016年12月15日，每個品種從田間隨機選取5株，分別調(diào)查葉齡、株高、單株分蘗數(shù)、單株葉片數(shù)和發(fā)生凍害葉片數(shù)。小麥越冬期凍害主要表現(xiàn)為葉片干黃[26-27]，多數(shù)發(fā)生在葉尖部位，單個葉片凍傷面積超過10%即視為凍傷葉片，通過調(diào)查葉片凍傷率來反映小麥田間凍害情況，葉片凍傷率=單株凍傷葉片數(shù)/單株葉片總數(shù)。

1.3 葉綠素熒光參數(shù)測定

葉片先暗適應 20min，然后利用 M-PEA（Hansatech，英國）測定葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線（O-J-I-P曲線），測定位置為小麥最新完全展開葉的中間部位，每個品種測定5次。O-JI-P曲線由 5000μmol/(m2·s)的脈沖光誘導，熒光信號記錄從10μs開始至2s結束，記錄的初始速率為每秒105個數(shù)據(jù)。用JIP-test分析O-J-I-P曲線，計算熒光參數(shù)[28-30]（表2）。

表2 O-J-I-P曲線參數(shù)及計算公式Table 2 Parameters and formula of O-J-I-P curve

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Office 2019和 SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 越冬期氣候條件

2016-2017年度小麥生育期內(nèi)的溫度變化如圖1所示，該年度11月份氣溫下降速度較快，且低溫持續(xù)時間較長，11月至12月中旬日最低氣溫≤0℃的天數(shù)達到了17d（圖2），該氣象條件為小麥苗期凍害的發(fā)生提供了客觀條件。

圖1 2016-2017年度小麥生育期溫度變化Fig.1 Temperature change during wheat growth period in 2016-2017

圖2 2016年11月1日至12月15日日最低氣溫頻率分布圖Fig.2 Distribution of daily minimum temperature frequencies from November 1st to December 15th in 2016

2.2 小麥越冬期生長指標和凍害情況

在田間已經(jīng)可以看到小麥發(fā)生了明顯的凍害。生長指標調(diào)查結果（表3）顯示，33個小麥品種株高范圍為16.40～31.56cm，單株分蘗數(shù)范圍為6.00～11.00，單株葉片數(shù)范圍為16.80～34.40。33個小麥品種的單株受凍葉片數(shù)為1.60～8.60。所有品種中葉片凍傷率最高為 0.41，最低為 0.05，變異系數(shù)為0.43，表明品種之間對冬季低溫凍害的抵抗力有較大差異。通過圖3可以看出，所有品種的凍傷率多數(shù)集中在0.10～0.20，葉片凍傷率≤0.10和＞0.30的品種較少。

圖3 小麥品種葉片凍傷率頻率分布直方圖Fig.3 Histogram of leaf frostbite rates of wheat varieties

表3 不同小麥品種越冬期凍害調(diào)查Table 3 Investigation on freezing damage of different wheat varieties during over winter

續(xù)表3 Table 3 (continued)

2.3 小麥葉片凍傷率和生長指標的相關性

小麥的生長狀況和凍害發(fā)生有密切聯(lián)系，如圖4所示，葉片凍傷率和株高呈顯著正相關，而與單株分蘗數(shù)呈負相關，而株高越高表明小麥葉片生長速率較快，將更多的物質(zhì)和能量用于葉片的伸長而不是分蘗數(shù)量的增加，同時也導致葉片凍傷率升高。

圖4 小麥葉片凍傷率和生長指標的相關性Fig.4 Correlation between leaf frostbite rates and growth indexes of wheat

2.4 葉綠素熒光參數(shù)與小麥凍害的相關性

為了建立葉綠素熒光與小麥葉片凍害的聯(lián)系，計算了常用的34個葉綠素熒光參數(shù)（表2），分別與小麥葉片凍傷率進行相關性分析，從中篩選出了相關性最強的 5個正相關參數(shù)（TRo/CSm、Fm、ETo/CSm、RC/CSm、Fv/Fm）和2個負相關參數(shù)（DIo/RC和 φDo）（表4）。其中，與小麥凍害正相關性最強的參數(shù)是TRo/CSm，負相關性最強的是φDo。

表4 與小麥凍傷率相關性最強的7個熒光參數(shù)Table 4 Seven fluorescence parameters with the strongest correlation with frostbite rates of wheat

2.5 葉綠素熒光參數(shù)與小麥株高的相關性

Fv/Fm是最常用的葉綠素熒光參數(shù)，TRo/CSm是篩選出的與小麥葉片凍傷率相關性最強的熒光參數(shù)，為了進一步研究小麥越冬期生長、葉綠素熒光參數(shù)和小麥凍害之間的關系，分析了株高與葉綠素熒光參數(shù) Fv/Fm、TRo/CSm之間的關系，如圖 5所示，小麥株高與Fv/Fm和TRo/CSm均呈顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.459和0.420。

圖5 葉綠素熒光參數(shù)與小麥株高的相關性Fig.5 Correlation between chlorophyll fluorescence parameters and plant height of wheat

3 討論

2016年11月后，試驗所在地原陽縣的氣溫快速下降，11月至12月15日間有17d最低氣溫都≤0℃，為小麥凍害發(fā)生提供了客觀條件。冬小麥在越冬期遭遇凍害的主要形態(tài)表現(xiàn)為葉片從葉尖開始黃化和死亡，本研究所選用的33個小麥品種在越冬期的葉片凍傷率為0.05～0.41，基本涵蓋了高抗性、中抗性和低溫敏感型的完整區(qū)間，因此，適用于研究和篩選小麥低溫抗性指標。大量研究[31-32]表明，小麥冬季旺長容易導致凍害的發(fā)生，在本試驗中隨著小麥株高的增加，小麥葉片凍傷率也逐漸增加，這與前人研究[31-32]結果相符。

葉綠素熒光誘導動力學曲線蘊含了豐富的光合作用相關的信息，并且具有快速、高效、無損傷等優(yōu)點。在小麥逆境相關研究中，葉綠素熒光技術也已經(jīng)被廣泛應用，有研究[8]表明，在低溫脅迫下，小麥葉片F(xiàn)v/Fm和光合速率均顯著下降，也有研究[21]表明，F(xiàn)v/Fm可以作為反映小麥抗寒性的指標，在本試驗中，F(xiàn)v/Fm和小麥葉片凍傷率呈顯著正相關，表明隨著Fv/Fm的升高，凍害程度也呈升高趨勢，這與前人研究[21]結果相反，可能是因為前人研究結果是基于少數(shù)品種，在人工氣候室中結果更易受特異個體的影響，并且不能充分反映實際大田環(huán)境[18]，而本試驗是基于33個小麥品種，測定過程是在自然越冬期低溫凍害發(fā)生的情況下進行，更具有代表意義。

TRo/CSm、Fm、ETo/CSm和RC/CSm4個參數(shù)與葉片凍傷率呈正相關關系，其中TRo/CSm與凍傷率的相關性最強。該結果表明TRo/CSm可以作為小麥抗寒性指標，且優(yōu)于其他葉綠素熒光參數(shù)。TRo/CSm表示葉片單位面積活性反應中心捕獲的光能[29]，在本試驗中 TRo/CSm越高的品種葉片受凍越嚴重。TRo/CSm和 Fv/Fm均與株高呈顯著正相關，表明TRo/CSm和Fv/Fm越高，則葉片光合能力也越強，生長速率也越快，從而凍害發(fā)生率也越高，因此可以用來評價小麥抗寒性。

4 結論

通過分析越冬期33個小麥品種凍害程度與34個常用的葉綠素熒光誘導動力學參數(shù)的相關性，篩選出了正相關參數(shù)TRo/CSm，其與小麥葉片凍傷率的相關系數(shù)達到0.636，表明TRo/CSm可以作為評價小麥越冬期抗寒性的指標，且優(yōu)于傳統(tǒng)指標Fv/Fm。小麥抗寒性的無損評價方法可以為小麥抗寒生理研究、越冬期田間管理和抗寒育種提供參考。