花椒總生物堿提取工藝及抗氧化活性研究

張文艷，陳 茜，李俊杰，趙仲霞

（昭通學(xué)院，云南昭通 657000）

花椒屬蕓香科，在全球范圍內(nèi)大概有200多種，主要品種為青椒和花椒[1]。花椒屬植物主要活性成分為揮發(fā)油[2]、生物堿類(lèi)化合物、香豆素[3]等。生物堿[4]是一類(lèi)含氮有機(jī)化合物，具有抗氧化[5]、抗肥胖、抗糖尿病[6]、抗菌[7]等活性。花椒生物堿是花椒屬植物中普遍含有的一類(lèi)物質(zhì)[8]，花椒中被發(fā)現(xiàn)的生物堿主要有香草檸[9]、和帕洛平[10]、青椒堿[11]。生物堿的主要檢測(cè)方法有電位滴定[12]、紫外吸收、酸性染料比色[13]等，提取方法主要有水提取、氨-氯仿[14]、有機(jī)溶劑、超聲波等[15]。

青花椒在云南省的大部分地區(qū)均有分布和栽培[16]，昭通地區(qū)青花椒種植面積超過(guò)6.7萬(wàn) hm2，產(chǎn)量占全省的60%～70%[17]，主要分布在金沙江、牛欄江、關(guān)河、洛澤河流域[18]，海拔400～1 800 m的永善縣務(wù)基鎮(zhèn)、黃華鎮(zhèn)、大興鎮(zhèn)、馬口鎮(zhèn)，魯?shù)榭h龍頭山鎮(zhèn)、梭山鄉(xiāng)，彝良縣角奎鎮(zhèn)、洛澤河鎮(zhèn)，巧家縣紅山鄉(xiāng)、大寨鄉(xiāng)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)[19-20]。本文以昭通大關(guān)縣青花椒為原料，采用醇提法考察生物堿提取量，以DPPH、ABTS+為檢測(cè)指標(biāo)，探究花椒生物堿的抗氧化作用，以期為昭通金江花椒作為天然抗氧化劑在食品中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

青花椒（昭通大關(guān)縣）；白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品（江蘇永健醫(yī)藥科技公司）；溴麝香草酚藍(lán)（成都科隆化學(xué)品有限公司）；無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇（天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；DPPH自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；96孔板（NEST）；移液槍?zhuān)ù簖垼欢喙δ苊笜?biāo)儀（Moleculart Devuces）；紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；超聲雙頻清洗機(jī)（寧海新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

參照姜華等[21]的方法，稱(chēng)取60目花椒粉加入乙醇溶液，室溫避光浸泡24 h，設(shè)置溫度、時(shí)間進(jìn)行超聲后回流提取2 h，收集濾液濃縮至浸膏狀備用。將花椒浸膏用無(wú)水乙醇配制一定濃度后，取200 μL于離心管中，加入相應(yīng)濃度的乙醇溶液800 μL進(jìn)行溶解，加入400 μL溴麝香草酚藍(lán)溶液，搖勻后加入2 mL三氯甲烷，靜置30 min，取三氯甲烷層進(jìn)行測(cè)定。以相應(yīng)濃度乙醇溶液做空白，在波長(zhǎng)417 nm下用酶標(biāo)儀檢測(cè)生物堿吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算花椒中生物堿含量。

1.2.2 對(duì)照品的配制

稱(chēng)取5.00 mg白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品，加無(wú)水乙醇定容至25 mL混勻，即為0.2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

1.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

取兩支比色管，加入200 μL對(duì)照品溶液、200 μL花椒生物堿浸膏液，加去離子水至1 mL后加入pH值為7.6的400 μL溴麝香草酚藍(lán)緩沖溶液，加入2 mL三氯甲烷后按照1.2.1方法進(jìn)行測(cè)定。以酸性染料緩沖溶液的三氯甲烷為空白，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。掃描結(jié)果如圖1所示，白屈菜紅堿與花椒生物堿在289 nm和417 nm處存在較高的吸收峰，結(jié)合后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，417 nm下回歸方程相關(guān)系數(shù)R2較好，最終選擇417 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 白屈菜紅堿與花椒生物堿全波長(zhǎng)掃描圖譜

1.2.4 白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別取5只比色管標(biāo)號(hào)，依次加入0 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL 白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品后，加水至 1 000 μL，再分別加入 400 μL、pH 7.6的溴麝香草酚藍(lán)緩沖溶液，加入2 mL三氯甲烷振蕩2 min，按照1.2.1方法進(jìn)行測(cè)定。空白為三氯甲烷酸性染料緩沖溶液，在417 nm處測(cè)定后作圖，得白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=1.74x-0.002 5，R2=0.966 2，表明其具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)使用。

1.2.5 花椒生物堿提取條件的確定

以花椒生物堿含量為檢測(cè)指標(biāo)，探究乙醇濃度（%）、超聲時(shí)間（min）、超聲溫度（℃）、料液比（g∶mL）對(duì)花椒生物堿提取率的影響，確定最適的花椒生物堿提取條件。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)采用L9(34)的方法（表1）進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳生物堿提取工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3 花椒生物堿活性檢測(cè)

1.3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將花椒生物堿稀釋90倍后25 ℃避光反應(yīng)30 min，在517 nm下檢測(cè)。清除率公式表示為

式中：A0為樣品測(cè)定吸光值；A1為樣品對(duì)照吸光值；A2為空白吸光值。

1.3.2 總抗氧化能力的測(cè)定

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將花椒提取液稀釋150倍后25 ℃反應(yīng)6 min，在405 nm下檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒生物堿提取條件的確定

2.1.1 乙醇濃度對(duì)花椒生物堿得率的影響

分別測(cè)定乙醇濃度65%、70%、75%、80%、85%對(duì)花椒生物堿得率的影響。由圖2可得，乙醇濃度在75%時(shí)，花椒生物堿得率最高。

圖2 乙醇濃度對(duì)花椒生物堿得率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)花椒生物堿得率的影響

分別測(cè)定超聲時(shí)間40 min、50 min、60 min、70 min、80 min對(duì)花椒生物堿得率的影響。由圖3可得，超聲時(shí)間為60 min時(shí)，花椒生物堿得率最高。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)對(duì)花椒生物堿得率的影響

2.1.3 超聲溫度對(duì)花椒生物堿得率的影響

分別測(cè)定超聲溫度 10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃對(duì)花椒生物堿得率的影響。由圖4可得，超聲溫度為40 ℃時(shí)，花椒生物堿得率最高。

圖4 超聲溫度對(duì)花椒生物堿得率的影響

2.1.4 料液比對(duì)花椒生物堿得率的影響

分別測(cè)定料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35對(duì)花椒生物堿得率的影響。由圖5可得，料液比為1∶25時(shí)，花椒生物堿得率最高。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。由表2中R值可知，乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素對(duì)花椒生物堿得率的影響程度依次為料液比＞超聲溫度=超聲時(shí)間＞乙醇濃度。通過(guò)正交試驗(yàn)分析，生物堿得率最高是 1.410 μg·mL-1，對(duì)應(yīng)組合為A2B2C3D3，即乙醇濃度為75%、料液比（g∶mL）1∶25、溫度50 ℃、時(shí)間70 min。通過(guò)極差分析，生物堿最佳提取工藝為A2B2C1D1，即乙醇濃度為75%、料液比（g∶mL）1∶25、溫度30 ℃、時(shí)間50 min。因此進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，花椒生物堿提取工藝為A2B2C1D1時(shí)，得率 1.553 μg·mL-1，高于 1.410 μg·mL-1，即在乙醇濃度為75%、料液比（g∶mL）1∶25、溫度30 ℃、時(shí)間50 min的提取條件下，花椒生物堿得率最高。

表2 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析

2.3 花椒生物堿提取物抗氧化性檢測(cè)

分別按照DPPH和ABTS+自由基清除能力試劑盒方法制得以下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.066 5x+0.040 4，R2=0.983 4和y=-0.638 3x+1.661 6，R2=0.990 1，均具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)使用。花椒生物堿提取液對(duì)DPPH、ABTS+自由基的清除能力分別如下：稀釋90倍的花椒生物堿提取液的DPPH自由基清除能力為 642.937 5 μg Torlox/mL，比對(duì)照高15%；稀釋150倍的花椒生物堿提取液對(duì)ABTS+自由基的清除能力相當(dāng)于18.47 mmol·L-1的Trolox溶液，比對(duì)照高8%，表明花椒生物堿提取液具有良好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本文對(duì)昭通金江花椒生物堿提取工藝及抗氧化作用進(jìn)行研究，測(cè)定花椒生物堿在不同提取條件下生物堿得率的變化及抗氧化能力。結(jié)果表明，采用60目花椒，在乙醇濃度75%、料液比1∶25、超聲時(shí)間50 min、超聲溫度30 ℃的提取條件下，花椒生物堿得率最高，對(duì)DPPH自由基的清除能力達(dá)到642.9375 μg Torlox/mL，對(duì) ABTS+自由基的清除能力相當(dāng)于18.47 mM的Trolox溶液，表明其具有良好的抗氧化作用。