豬肉中沙門氏菌的分離鑒定及氧化石墨烯納米銀復合材料對其抗菌效果的研究

侯俊寧，王璇姝，余 權，陳奕嶠，姚小艷，楊粵軍

（湖南師范大學醫學院，湖南長沙 410006）

沙門氏菌作為一種致病菌，其引起的癥狀主要有惡心、嘔吐、腹瀉等，平均致死率為4.1%[1]。在大多數國家由沙門氏菌引起的食源性疾病居細菌性食源性疾病的首位[2]。若濫用抗生素來治療沙門氏菌病，則會導致沙門氏菌對多種抗生素的耐藥性日益加劇。因此，需要迫切研制出針對沙門氏菌有高療效且不會引起耐藥性的藥物。納米技術作為如今研究的熱點，為耐藥細菌感染治療提供了有效的選擇，其中氧化石墨烯納米銀復合材料（GO-Ag）最具代表性。

納米銀具有小尺寸效應、較大的表面積，抗菌性能優良，但其易發生氧化而影響其抗菌性能[3]。氧化石墨烯是石墨烯的衍生物之一，能夠負載多種抗菌材料，如納米銀、納米銅等，這些復合物具備更強的抗菌性能[4]。已有研究發現，氧化石墨烯納米銀復合物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種細菌均有良好的抗菌作用。但有關GO-Ag對沙門氏菌的抗菌效果的研究很少。

因此，本研究旨在利用GO-Ag對市場豬肉中分離得到的沙門氏菌進行體外抗菌實驗，探究其對沙門氏菌的抗菌效果，為臨床治療沙門氏菌感染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原位還原法合成GO-Ag：將0.88 mg硝酸銀在不斷攪拌下加入0.44 mL 2 mg·ml-1GO中混勻，并加入H2O至100 mL，在100 ℃油浴中煮沸，再加入40 mg檸檬酸三鈉，充分混勻，1 h后離心去上清液并水洗多次，將沉淀物置于無菌去離子水中超聲分散后得到所需的GO-Ag懸濁液。原液濃度為600 ug·mL-1。

新鮮豬肉，長沙市某生鮮市場豬肉攤販；BPW、HE瓊脂、LB瓊脂、MH肉湯和RV肉湯，青島海博生物技術有限公司；沙門氏菌屬診斷血清、腸桿菌科試劑鑒定盒，湖南佑峰科技有限公司；生物安全柜，上海力申科學儀器有限公司；電熱壓力滅菌器，山東新華醫療器械股份有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海福瑪實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本

采用滅菌棉簽擦拭豬肉進行取樣，置于裝有25 mL BPW的滅菌錐形瓶中，取樣10份。2 h內冷凍運送至實驗室進行前增菌培養。

1.2.2 前增菌培養

將樣液置于裝有225 mL BPW三角瓶中，充分搖勻后置于恒溫箱中37 ℃培養8 h。

1.2.3 選擇性增菌培養

稱取RV肉湯2.71 g，制成溶液，高溫高壓滅菌20 min，備用。取1 mL增菌液置于10 mL RV肉湯試管中，于42 ℃培養18～24 h。

1.2.4 分離培養

稱取HE（瓊脂）30.24 g煮沸溶解，冷卻后進行倒平板。用接種環挑取增菌培養液接種于HE平板上，于37 ℃恒溫箱培養24 h。

1.2.5 純化培養

用接種針挑取少量HE平板中疑似菌落接種于HE平板和克氏雙糖鐵培養基中。于37 ℃恒溫培養24 h。

1.2.6 生化鑒定實驗

用接種環挑取可疑菌落置于生化培養液中研磨，調整細菌濁度至0.5麥氏單位，吸取100 μL加入各生化試驗孔。置于相對濕度≥70%，35 ℃培養箱中培養。培養16～20 h后，判讀并記錄結果。

1.2.7 常量肉湯稀釋法測MIC

配制好濃度為0.4 mg·mL-1的GO-Ag。取11只普通試管并編號，除第一管加入1.36 mL MH肉湯外，其余各管加入1 mL MH肉湯，121 ℃，高壓滅菌15 min。吸取0.4 mg·mL-1GO-Ag 0.64 mL于1號試管中并充分混勻，再吸取1 mL至2號試管中，充分混勻。依次類推至第9號試管，使9只試管濃度分別為 128.0 μg·mL-1、64.0 μg·mL-1、32.0 μg·mL-1、16.0 μg·mL-1、8.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1。 再 用 接 種 環 挑 取 菌 落于裝有生理鹽水的試管中校正至0.5麥氏比濁標準濃度，吸取0.1 mL至1～10號試管中，其中第10號試管作為菌液對照組，另取11號管中加入1 mL MH肉湯作為陰性對照，置于35 ℃恒溫箱中培養16～20 h后觀測結果。根據NCCLS標準讀取MIC，即在讀取結果前先檢查10號管中細菌的生長情況是否良好，以及11號管是否有雜菌污染，同時以肉眼觀察各藥物濃度組試管，藥物最低濃度管無細菌生長者即為受試菌的MIC。

1.2.8 傾注平板計數法

取15個平皿分成3組，分別標記濃度為64 μg·mL-1、32 μg·mL-1、16 μg·mL-1。配制 GO-Ag濃度分別為 64 μg·mL-1、32 μg·mL-1、16 μg·mL-1，菌液濃度為1×103CFU·mL-1的混合液，充分混勻后倒置于5個平板中，于35 ℃恒溫箱中培養18～24 h 后計數菌落。取5 個平板，倒入 20 mL 64 μg·mL-1環丙沙星和1×103CFU·mL-1菌液的LB瓊脂混合液作為陽性對照。取5個平板，倒入20 mL菌液濃度1×10 CFU·mL-1的LB瓊脂混合液作為陰性對照（計數結果*100為最終計數結果）。取5個平板，倒入20 mL配制好的LB瓊脂作為空白對照。倒置于恒溫箱中37 ℃培養18～24 h后計數。

2 結果與分析

2.1 GO-Ag制備及表征

合成的GO-Ag外觀為灰色液態，紫外光譜顯示其在400 nm附近出現了明顯的吸收峰，此為納米銀的特征吸收峰，表明有大量的銀顆粒生成（見圖1）。

圖1 GO-Ag材料紫外光譜表征圖

2.2 分離株的培養及形態特性

HE平板上長出中心為黑色，周圍為藍綠色的菌落；克氏雙糖鐵試管中試管上部為紅色，下部為黑色，符合沙門氏菌培養及形態特性。

2.3 生化鑒定結果

運用自動分析系統分析實驗結果，分離菌株有98.61%的鑒定概率為沙門氏菌（見表1）。

表1 生化鑒定結果

2.4 MIC的測定結果

肉眼觀察到2號試管即GO-Ag濃度為64 μg·mL-1的試管中澄清，與空白對照管相一致，即肉眼下判定為無細菌生長，實驗結果重復3次，因此可判定該GO-Ag對該株豬霍亂沙門氏菌的MIC 為 64 μg·mL-1（見圖 2）。

圖2 常量肉湯稀釋法MIC結果

2.5 平板菌落計數結果

圖3中a、b、c及e分別代表當GO-Ag濃度為64 μg·mL-1、32 μg·mL-1、16 μg·mL-1及環丙沙星濃度為 64 μg·mL-1的菌落圖。圖 3 中（d）為陰性對照。由圖3觀察到當復合材料濃度達到所測得的MIC（64 μg·mL-1）時，其菌落數仍遠大于 300 CFU，為多不可計，同時 32 μg·mL-1、16 μg·mL-1組也為多不可計，但比 64 μg·mL-1組更為密集。陰性對照組菌落數在乘100倍后明顯較實驗組菌落密集。但64 μg·mL-1環丙沙星組未見任何菌落。因此，此實驗表明GO-Ag對于沙門氏菌具有一定的抗菌作用，且與其濃度有關，但其抗菌效果不及環丙沙星（見圖3）。

圖3 平板菌落計數結果

3 討論

目前眾多研究表明GO-Ag具備優良的抗菌性能，且不會誘導產生耐藥性，已有研究結果顯示GO-Ag對G-大腸桿菌和G+金黃色葡萄球菌均具有較好的抗菌性能，且對前者的抑菌作用大于后者[5]。DE 等[6]研究發現 15 μg·mL-1的 GO-Ag 分別作用于大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌2 h和4 h就能完全殺死細菌；JAWORSKI等[7]同樣報道了GO-Ag作用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，24 h后其活性分別降低了88.6%、79.5%和76.5%；秦靜等[8]研究表明 GO-Ag 濃度為40 μg·mL-1時可完全抑制大腸桿菌的生長；蔣佳佳等[9]研究表明GO-Ag對大腸桿菌具備優越的抗菌性能，測得的MIC 為 5 μg·mL-1；唐佳[10]研究表明 GO-Ag 納米復合物對大腸桿菌的 MIC 為 4 μg·mL-1。

本研究結果顯示，GO-Ag能抑制沙門氏菌生長的最低濃度為64 μg·mL-1，而蔣佳佳以及唐佳研究中所報道 GO-Ag 對大腸桿菌 MIC 分別為 5 μg·mL-1、4 μg·mL-1，結果相差 10 倍以上。這表明 GO-Ag 對沙門氏菌的抗菌作用遠遠弱于大腸桿菌，在G-菌中各種細菌對GO-Ag的敏感性均不一樣。筆者認為結果之間的差異除了與使用的測量方法不同而存在誤差外，更多的可能是細菌種屬因素導致了如此大的差異。此外，筆者利用測得的MIC做抑菌實驗時得到的抑菌效果不理想，且在同等濃度下，GO-Ag的抗菌能力遠遠不及環丙沙星。這一結果表明GO-Ag對于豬霍亂沙門氏菌的抗菌性能較弱，其在臨床上的應用效果相對于傳統抗生素而言不存在藥效上的優勢。

本實驗研究結果尚存在一定的局限性。此實驗僅使用一株沙門氏菌進行GO-Ag抗菌實驗，在一定程度上代表性較差，對于客觀地體現出GO-Ag對沙門氏菌的抗菌性能存在一定的偏差。

通過此次實驗結果可看出GO-Ag對于沙門氏菌確實具有一定的抑菌性能，但作用相對來說較弱，且GO-Ag作為一種復合材料其穩定性以及對于機體毒性方面都是一個尚待解決的問題。因此，對于GO-Ag未來運用于臨床仍需要克服許多問題，如進一步提高GO-Ag的抗菌性能及其結構的穩定性、減少其在人體中的毒性等。

4 結論

綜上，本研究結果顯示GO-Ag對市場豬肉中分離得到的沙門氏菌具有一定的抗菌性能，測得的MIC 為 64 μg·mL-1，為臨床上治療沙門氏菌引起的疾病提供了一個新的思路，但其抗菌效果與臨床上常用的抗沙門氏菌抗生素環丙沙星存在較大的差距，從而在一定程度上限制了其在臨床上防治沙門氏菌病的應用。