三華李紅色素的提取及抗氧化性的測(cè)定

劉艷燦，朱仕蘭，崔燕玲，賀勁鋒，高柔敏，許伊妍

（佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528000）

三華李為薔薇科李屬植物，果實(shí)為圓形或近圓形，果皮淡紫色，果肉紫紅色[1]。因早在廣東韶關(guān)翁源縣三華鎮(zhèn)種植而得名，近年來(lái)廣東信宜“銀妃”三華李因果大、肉厚、汁甜、色美屢屢在國(guó)內(nèi)省內(nèi)名特優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品展示和質(zhì)量評(píng)比活動(dòng)中獲譽(yù)[1]。研究表明，三華李的果實(shí)含有豐富的礦質(zhì)元素（如鉀、鈉、磷、鎂、鋅和銅等）和維生素（如維生素A、維生素D、維生素B1和維生素B2等），且其有機(jī)酸含量和種類尤其豐富，對(duì)人體健康大有裨益[2-3]。

近年來(lái)，對(duì)三華李的產(chǎn)品加工主要集中在果肉制作，如腌制成蜜餞、制作成果糕、釀制果酒，但是對(duì)其剩余物的有效成分的綜合研究利用相對(duì)較少，如加工后剩余的果渣、果皮等[1,4-6]。這樣不僅造成果渣中有效成分的流失浪費(fèi)，嚴(yán)重時(shí)還可能污染環(huán)境[7]。目前的報(bào)道中對(duì)三華李的果實(shí)果渣進(jìn)行再利用提取其中天然色素的報(bào)道較少，本試驗(yàn)選擇提取三華李紅色素，其主要成分為花青素，花青素屬天然的水溶性色素，主要存在于果皮、果肉中[8-10]。

近年來(lái)，由非法添加物導(dǎo)致的食品安全事故頻繁發(fā)生，人們普遍擔(dān)心人工合成色素的安全性。由此，針對(duì)從植物組織中提取的安全無(wú)毒的天然色素的研究得到了廣泛的關(guān)注[11-13]。花青素對(duì)植物具有重要的生理功能，還具有抗氧化活性，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑和自由基清除劑，在食品、醫(yī)藥、化妝品等方面擁有較大的發(fā)展市場(chǎng)[14-16]。本試驗(yàn)探究了三華李中紅色素的提取工藝，同時(shí)對(duì)粗提取物測(cè)定抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)天然食用色素提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三華李品種為廣東省信宜市錢排鎮(zhèn)“銀妃”三華李；檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、乙醚、水楊酸、過(guò)氧化氫、FeSO4溶液、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和L(+)-抗壞血酸和2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT），均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝

三華李紅色素的提取工藝為果肉預(yù)處理→加入提取劑并搗碎→室溫酶解→抽濾得濾液→真空濃縮→紅色素濃縮液。

1.3.2 最佳波長(zhǎng)的確定

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)得出，三華李紅色素最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為460 nm。

1.3.3 提取劑的選擇

取去核果肉加入料液比1∶1（m∶V）的提取劑[pH=4的緩沖溶液（檸檬酸鈉、磷酸）、pH=4的50%乙醇、pH=4的無(wú)水乙醇、磷酸鈉緩沖溶液和pH=4的乙醚]，搗碎后在室溫條件下放置20 min，抽濾并收集濾液，分別將濾液稀釋50倍在460 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，確定提取效果最佳的提取劑。

1.3.4 三華李紅色素提取條件的單因素試驗(yàn)

盡管生物質(zhì)能烤房設(shè)備烘烤煙葉燃燒的都是生物質(zhì)。但由于不同設(shè)備對(duì)溫濕度控制的響應(yīng)速度和協(xié)同運(yùn)行效率不同，可直接影響整個(gè)烤房供熱設(shè)備的綜合熱效率，進(jìn)而影響煙葉烘烤成本及推廣價(jià)值。從表2可知，單烤燃料消耗，常規(guī)燃煤烤房(CK)為727 kg，不同生物質(zhì)能烤房為848～906 kg，生物質(zhì)燃燒機(jī)烘烤煙葉消耗燃料比燃煤高，其主要原因是生物質(zhì)顆粒的燃值低于煤炭的燃值。綜合熱效率，生物質(zhì)燃燒機(jī)熱效率比燃煤烤房高13%～15%。不同類型的生物質(zhì)烤房的熱效率各有差異，其中，T3最高，達(dá)51.9%；T2其次，為50.8%；T4最低，僅48.3%，但仍高于CK。

（1）料液比的確定。取等量三華李去核果肉加入不同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液并搗碎，在室溫條件下放置20 min，抽濾并收集濾液，濾液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，確定提取效果最佳的料液比。

（2）放置時(shí)間的確定。分別取等量三華李去核果肉加入相同提取劑后搗碎，在室溫條件下放置0 min、10 min、20 min、30 min和40 min，抽濾并收集濾液，濾液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，確定提取效果最佳的放置時(shí)間。

（3）放置溫度的確定。分別取等量三華李去核果肉加入相同提取劑后搗碎，在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃下放置一定時(shí)間，抽濾并收集濾液，濾液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，確定提取效果最佳的放置溫度。

（4）旋蒸溫度的確定。分別取等量三華李去核果肉加入相同提取劑后搗碎，在一定溫度下放置一定時(shí)間，抽濾并收集濾液，濾液于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃旋蒸60 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，確定提取效果最佳的旋蒸溫度。

（5）旋蒸時(shí)間的確定。分別取等量三華李去核果肉加入相同提取劑后搗碎，在一定溫度下放置一定時(shí)間，抽濾并收集濾液，在一定溫度下旋蒸40 min、50 min、60 min、70 min和80 min，取得粗提物，分別將粗提取物稀釋50倍在460 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，確定提取效果最佳的旋蒸時(shí)間。

1.3.5 三華李紅色素抗氧化性質(zhì)研究

（1）羥基自由基（·OH）清除能力測(cè)定[17-18（]同時(shí)以抗壞血酸進(jìn)行同樣處理作為參照）。將粗提物加入95%乙醇定容至10 mL，取樣品溶液1 mL，依次加入2 mL濃度為6 mmol·L-1的FeSO4溶液，再加入6 mmol·L-1H2O2溶液2 mL，充分混勻后室溫靜置10 min，加入2 mL新配制的6 mmoL·L-1水楊酸溶液并混勻，在37 ℃下放置30 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度值。同時(shí)進(jìn)行空白（A0）和樣品對(duì)照（A1）處理，樣品溶液對(duì)羥自由基（·OH）的清除率的計(jì)算公式為

式中：A為試驗(yàn)組（樣液+水楊酸）吸光度值；A1為對(duì)照組（樣液+空白溶劑）吸光度值；A0為空白組（水楊酸+空白溶劑）吸光度值。

（2）DPPH自由基清除能力測(cè)定。以95%的乙醇作為溶劑，將DPPH自由基配制成濃度為0.1 mmol·L-1的溶液，DPPH溶液要現(xiàn)配現(xiàn)用。取不同濃度的紅色素溶液各1.0 mL，加入等體積的DPPH溶液，充分混合，在室溫25 ℃下避光放置30 min，測(cè)定混合溶液在517 nm處的吸光度，以95%乙醇作為空白對(duì)照。再以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照，在相同條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[19]。DPPH自由基陽(yáng)離子清除率計(jì)算公式為

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

不同提取劑對(duì)三華李紅色素的提取效果的影響結(jié)果見表1。各類提取劑對(duì)三華李紅色素的提取效果為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液提取三華李紅色素的吸光度與色澤效果最好，溶液顏色呈紫紅色，與果肉顏色很貼近；磷酸鈉緩沖溶液在浸提中溶液色澤也接近原果肉色，但吸光度較低；50%乙醇和乙醚在浸提中濾液顏色與其他提取劑區(qū)別較大，為黃色和淡黃色，提取物可能多為黃酮類成分物質(zhì)[7]。無(wú)水乙醇浸提后的溶液顏色比緩沖溶液浸提后的顏色偏淺，吸光度較低。因此，pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液提取三華李紅色素的效果最好。

2.2 不同條件下三華李紅色素的提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

由圖1可知，料液比在1∶1時(shí)三華李紅色素的吸光度值最大。料液比小于1∶1時(shí)，果肉破碎不夠完全影響色素的有效提取。當(dāng)料液比從1∶1到1∶3時(shí)，提取溶液的吸光度值急劇下降，而后呈緩慢下降趨勢(shì)，到1∶5時(shí)吸光度值的變化趨勢(shì)已比較平緩。可能是在超過(guò)合適的料液比后，增加提取劑的用量會(huì)稀釋提取出的三華李紅色素的濃度，導(dǎo)致吸光度值下降。而且過(guò)多的水分給后續(xù)的提取工作增加難度。因此，選擇料液比1∶1作為本試驗(yàn)的最佳料液比。

圖1 料液比對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

2.2.2 放置時(shí)間對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

由圖2可知，放置時(shí)間在0～20 min時(shí)，提取效果變化不明顯，當(dāng)放置時(shí)間增加到30 min后吸光值隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，當(dāng)放置時(shí)間為40 min時(shí)吸光度值急劇下降，與放置時(shí)間為20 min的提取效果差別不大。可能原因是放置時(shí)間較短時(shí)，三華李細(xì)胞未能充分吸水破裂導(dǎo)致色素成分無(wú)法釋放出來(lái)，當(dāng)放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)反應(yīng)酶與紅色素發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致紅色素含量下降，提取液的吸光度值下降。因此，最佳放置時(shí)間為30 min。

圖2 放置時(shí)間對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

2.2.3 放置溫度對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

由圖3可知，隨著放置溫度的升高，提取液的吸光度逐漸上升，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，吸光度達(dá)到最大。隨后，吸光度隨溫度的升高而下降。適宜的放置溫度能促進(jìn)三華李中紅色素的溶出，溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致色素分解或氧化。綜合考慮，選擇50 ℃作為三華李紅色素提取溫度，既可保證紅色素在此溫度下不被分解或被氧化，同時(shí)紅色素的浸出率較高。

圖3 放置溫度對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

2.2.4 旋蒸溫度對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

由圖4可知，旋蒸溫度在30～50 ℃時(shí)，吸光值隨溫度升高而升高。當(dāng)旋蒸溫度到50 ℃時(shí)提取液的吸光度值達(dá)到最大。繼續(xù)升高旋蒸溫度，吸光度開始緩慢下降。這可能是因?yàn)樾魷囟容^低時(shí)紅色素未能充分溶出，此時(shí)吸光度值較低，當(dāng)旋蒸溫度過(guò)高時(shí)，屬于熱敏性物質(zhì)的紅色素在高溫被結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致吸光度值下降。因此，最佳旋蒸溫度為50 ℃。

圖4 旋蒸溫度對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

2.2.5 旋蒸時(shí)間對(duì)三華李紅色素提取效果的影響

由圖5可知，旋蒸50 min時(shí)吸光度值達(dá)到最大，50 min后吸光度值呈緩慢下降的趨勢(shì)。原因可能是在一定范圍內(nèi)旋蒸時(shí)間的增加有利于紅色素的充分溶出，繼續(xù)增加旋蒸時(shí)間會(huì)使得溶出的紅色素在50 ℃的旋蒸溫度下逐漸被破壞分解。綜上，最佳旋蒸時(shí)間為50 min。

圖5 旋蒸時(shí)間對(duì)三華李紅色素提取效果的影響2.3 三華李紅色素抗氧化性的測(cè)定

2.3.1 三華李紅色素對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定

由圖6可知，三華李紅色素與維生素C對(duì)羥基自由基的清除率在試驗(yàn)濃度內(nèi)均隨質(zhì)量濃度的增加而增大。但相同濃度的維生素C對(duì)羥基自由基的清除能力比三華李紅色素強(qiáng)。綜上，三華李紅色素對(duì)羥基自由基有一定的清除能力。

圖6 三華李紅色素質(zhì)量濃度對(duì)羥基自由基的清除效果

2.3.2 三華李紅色素對(duì)DPPH清除能力的測(cè)定

由圖7可知，隨著試驗(yàn)濃度內(nèi)質(zhì)量濃度的增大，三華李紅色素與維生素C對(duì)DPPH的清除能力逐步提高。但相同濃度的三華李紅色素對(duì)DPPH的清除能力弱于維生素C的清除能力。綜上，三華李紅色素對(duì)DPPH有一定的清除能力。

圖7 三華李紅色素質(zhì)量濃度對(duì)DPPH的清除效果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以三華李為原料，提取的三華李紅色素是水溶性的天然色素。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了三華李中紅色素的最佳工藝條件為以pH=4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液作為提取劑，料液比為1∶1，放置溫度50 ℃，放置時(shí)間30 min，旋蒸溫度50 ℃下旋蒸50 min。在此條件下提取液的吸光度值最高且溶液呈紫紅色。此外，三華李紅色素對(duì)羥基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）有較好的清除能力，可為三華李的綜合利用提供較好的研究基礎(chǔ)。