寵物食品中沙門氏菌的快速檢測

王玉花，陶文靖，田秀梅，石 磊，梁啟美，韓 冀*

（1.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)（青島）有限公司，山東青島 266071；2.北京美正生物科技有限公司，北京 102200）

沙門氏菌是最常見的人畜共患病病原菌，會使人和動物出現(xiàn)胃腸炎和敗血癥等癥狀[1]。近年來，隨著我國寵物行業(yè)的快速發(fā)展，人們與寵物的關(guān)系越來越密切，寵物作為沙門氏菌宿主導(dǎo)致人類感染的風(fēng)險也日益引起關(guān)注。美國疾病控制中心發(fā)現(xiàn)，在28例沙門氏菌感染病例中有13人曾在患病前8天內(nèi)接觸過嚙齒動物[2]。寵物感染沙門氏菌的主要渠道是進食被污染的寵物食品和水，其中寵物食品在加工過程中，容易受到原料及添加劑的污染。WONG等[3]對新西蘭市場銷售的寵物咬膠進行了沙門氏菌檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新西蘭、中國、泰國和澳大利亞等各國產(chǎn)品中沙門氏菌的檢出率分別為6.7%、4.1%、3.7%和14.0%。史思等[4]調(diào)查了6家寵物食品加工企業(yè)的176份寵物食品，其中半成品沙門氏菌陽性率為7.55%，成品中陽性率為0.81%。秦超等[5]匯總分析了2012—2020年歐盟食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)（Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）中的飼料通報，RASFF共通報了188起寵物食品中檢出沙門氏菌的不合格情形，其中包括來自中國的犬貓飼料、狗咬膠和魚飼料等。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法有微生物分離純化、生化鑒定等[6]，其檢測周期長、檢測過程復(fù)雜、無法適應(yīng)快速檢測的需求。實時熒光PCR技術(shù)的迅速發(fā)展為快速準(zhǔn)確地鑒別寵物食品中的沙門氏菌提供了技術(shù)支持，但沙門氏菌類群繁多，需要篩選合適的引物及探針，同時寵物食品的成分復(fù)雜，需要尋找合適的樣品前處理方法，本研究擬建立了一種適合于寵物食品中沙門氏菌污染檢測的實時熒光PCR方法。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

鼠 傷 寒 沙 門 氏 菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、 腸 炎 沙 門 氏 菌（Salmonella enteritidis）CMCC50335、 傷 寒 沙 門 氏 菌（Salmonella typhi）CMCC50071、 嬰 兒 沙 門 氏菌（Salmonella infantis）CICC21482、 肯 塔 基 沙門 氏 菌（Salmonella kentucky）CICC21488、 大 腸桿 菌（Escherichia coli）ATCC8739、 福 氏 志 賀 氏菌（Shigella flexneri）ATCC12022、 副 溶 血 性 弧菌（Vibrio para）ATCC17802、 單 增 李 斯 特 氏 菌（Listria monocytogenes）ATCC19115、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027、 產(chǎn) 氣 腸桿菌（Enterobacter aerogenes）ATCC13048、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC4352、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC11778、糞腸球菌（Enterococcus faecium）ATCC8459和粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）ATCC14041。

1.2 試劑和設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Stepone plus實時熒光PCR儀，美國ABI；VORTEX3渦旋振蕩器，德國IKA；5424離心機，德國Eppendorf；BSC-1360-LIIB2生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AL204-IC電子天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；TaqMan Gene Expression Master Mix，美國Thermo Fisher；緩沖蛋白胨水（BPW），北京陸橋技術(shù)股份有限公司；引物及探針合成，英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司，見表1。

表1 沙門氏菌PCR引物和探針

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌基因組DNA提取

上述實驗菌株分別挑取一環(huán)接種至NB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用核酸蛋白儀測定其純度和濃度，提取后的模板DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 沙門氏菌實時熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL：2X TaqMan Gene Expression Master Mix 為 10 μL；引物 F（10 μmol·L-1）為 1 μL； 引 物 R（10 μmol·L-1）為 1 μL； 探 針 P（10 μmol·L-1）為 1 μL；DNA 模板為 4 μL；ddH2O 補齊至 20 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性 15 s，60 ℃退火 60 s，同時 FAM通道采集熒光信號，40個循環(huán)。

1.3.3 實時熒光PCR方法特異性驗證

提取5株沙門氏菌和10株非沙門氏菌DNA后，使用實時熒光PCR法檢測其特異性，驗證本研究建立的沙門氏菌PCR檢測方法的特異性，同時用無菌去離子水作空白對照。

1.3.4 寵物食品人工污染沙門氏菌的檢測

取4份全價營養(yǎng)貓糧各25 g，向其中添加鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028稀釋菌液，添加濃度分別為 1.9 CFU/25 g、9.5 CFU/25 g、19.0 CFU/25 g和95.0 CFU/25 g，加入225 mL滅菌BPW，同時做樣品的本底測試，振蕩混勻后36 ℃培養(yǎng)過夜，通過實時熒光PCR方法檢測沙門氏菌。

1.3.5 傳統(tǒng)微生物法與實時熒光PCR法的比較

根據(jù)產(chǎn)品形態(tài)劃分，寵物食品主要分為濕糧和干糧兩大類別，干糧分為低溫烘焙糧、高溫膨化糧、凍干糧和風(fēng)干糧等；濕糧可分為罐頭和鮮食等。分別使用國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中沙門氏菌的測定》（GB/T 13091—2018）[7]與實時熒光PCR法對表2中所列寵物食品各品類共37個樣品中的沙門氏菌進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光PCR方法特異性

采用實時熒光PCR法對5株沙門氏菌和10株非沙門氏菌進行檢測，5株沙門氏菌均有典型S型擴增曲線，而10株非沙門氏菌及空白對照均未產(chǎn)生擴增曲線，結(jié)果見表2。

表2 實時熒光PCR法檢測沙門氏菌的結(jié)果

2.2 寵物食品人工污染沙門氏菌的檢測

對4份全價營養(yǎng)貓糧進行人工污染實試驗后，通過實時熒光PCR方法檢測其中的沙門氏菌，結(jié)果表明，全價營養(yǎng)貓糧本底未檢出沙門氏菌，而各濃度污染樣品擴增后均可見典型S型擴增曲線，表明該方法檢測沙門氏菌的靈敏度可達到1.9 CFU/25 g，結(jié)果見圖1。

圖1 人工污染沙門氏菌樣品檢測

2.3 傳統(tǒng)微生物法與實時熒光PCR法的比較

選擇寵物食品各品類共37個樣品，模擬污染鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028后，采用《飼料中沙門氏菌的測定》（GB/T 13091—2018）傳統(tǒng)微生物學(xué)法進行沙門氏菌的檢測，同時取BPW增菌液提取DNA后進行沙門氏菌實時熒光PCR檢測。37份模擬污染寵物食品樣品均檢出沙門菌，詳見表3，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)微生物法一致。

表3 兩種檢測方法的檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

近年來，由寵物引發(fā)人類感染沙門氏菌的事件逐漸增多，已成為值得關(guān)注的健康問題，應(yīng)高度重視和預(yù)防寵物在感染事件發(fā)生及擴散中的負面作用。而寵物的沙門氏菌感染與所進食的寵物食品中的沙門氏菌污染有直接的關(guān)系[8]，沙門氏菌能通過被污染的食品、飼料感染人和動物，陳沁等[9]報道498份進口的動物源性飼料沙門氏菌陽性率為4.62%，周春紅等[10]對95份飼料進行沙門氏菌分離時，檢出陽性率為5.26%，這也要求企業(yè)在寵物食品加工過程中對沙門氏菌應(yīng)進行有效防范，從源頭斷絕沙門氏菌的污染可能。

目前寵物食品中沙門氏菌主要通過細菌分離、生化鑒定等傳統(tǒng)微生物學(xué)手段進行檢測，存在檢測周期較長、檢測過程煩瑣的弊端，無法適應(yīng)快速檢測的要求，同時對可疑菌落的選取存在主觀判斷性，容易出現(xiàn)漏檢，對檢測人員技術(shù)水平要求較高。而比較成熟的快速檢測沙門氏菌的方法有免疫學(xué)檢測技術(shù)[11]、分子生物學(xué)技術(shù)[12]、電化學(xué)檢測方法[13]和生物傳感器檢測技術(shù)[14]等，研究對象主要是食品樣品中的沙門氏菌檢測，而對寵物食品中沙門氏菌快速檢測方法的報道較少，本研究針對寵物食品特殊基質(zhì)，優(yōu)化了沙門氏菌的測試流程，采用實時熒光PCR法檢測，降低了試驗過程中因操作步驟復(fù)雜引起的誤差，與傳統(tǒng)的微生物法相比，具備良好的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。本研究檢測沙門氏菌的靈敏度可達到1.9 CFU/25 g，與賈俊濤和張秀芹等的研究結(jié)果一致[15-16]。研究同時表明，建立的實時熒光PCR方法和傳統(tǒng)微生物法檢測結(jié)果符合率為100%，可以推廣運用于寵物食品中沙門氏菌的快速檢測。