測定葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量的不確定度評估

田 璞，張世芹，吳新文

（貴州省檢測技術研究應用中心，貴州貴陽 550014）

不確定度是指實驗過程中由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度。本文依據《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[1]對《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》（GB 5009.86—2016）[2]中各因素進行評估，依據樣品的檢測結果，結合所用儀器等不確定度進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湯臣倍健葡萄籽維生素C加E片；L(+)-抗壞血酸（維生素C）：純度99.76%，Dr.Ehrenstorfer；偏磷酸、磷酸三納，分析純，國藥集團化學有限公司；L- 半胱氨酸溶液、磷酸，優級純，天津科密歐化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀、十六烷基三甲基溴化銨，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent1260液相色譜儀（配有1個四元泵、1個二元泵、1個兩位六通閥、1個三通接頭、1個紫外檢測器、1個熒光檢測器、自動進樣器和柱溫箱），美國Agilent公司；TG16W高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；ME204天平，美國梅特勒-托利多公司；Mil-lQ 型超純水儀，德國Merck公司；vortex-genie2渦旋混合器，美國Scientif-ic Industries公司；S220型pH計，精度±0.01，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

L(+)-抗壞血酸標準貯備液（0.001 g·mL-1）的配制：準確稱取L(+)-抗壞血酸的標準樣品0.01 g，用濃度為20 g·L-1的偏磷酸定容至10 mL。儲存條件為2～8 ℃避光條件下可保存7 d。

抗壞血酸標準系列工作液的配制：分別吸取L(+)-抗壞血酸標準貯備液0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL和10.0 mL，用20 g·L-1的偏磷酸溶液定容至100 mL，標準系列工作液中L(+)-抗壞血酸的濃度分 別 為 1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和 100.0 μg·mL-1。現配現用。

1.3.2 試樣制備

試樣溶液的制備：稱取樣品約1.0 g（精確至0.001 g）于 25 mL 燒杯中，用濃度為 20 g·L-1的偏磷酸溶液將其轉移至25 mL的容量瓶中，充分溶解并搖勻后定容。試樣搖勻后將其全部轉移到25 mL離心管中，用超聲機超聲提取5 min后，將試樣于4 000 r·min-1離心 5 min，取上清液。

試樣溶液的還原：用移液槍準確吸取20 mL上述離心后的上清液于50 mL離心管中，加入10 mL濃度為 40 g·L-1的 L- 半胱氨酸，用 100 g·L-1磷酸三納溶液調節pH至7.0～7.2，以200次/min振蕩5 min后，用磷酸調節pH值至2.5～2.8，用水將溶液全部轉移至50 mL容量瓶中，定容至刻度，過0.45 μm水相濾膜，濾液待測。

1.3.3 儀器條件

色譜柱為 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；紫外檢測波長245 nm；柱溫25 ℃；進樣體積20 μL。流動相A的配制條件為稱取6.8 g磷酸二氫鉀與0.91 g十六烷基三甲基溴化銨，加水充分溶解混勻并定容至1 L（用磷酸調節pH值為2.5～2.8）；流動相B為甲醇（100%）；流動相A與流動相B的比例為98∶2，過濾膜，超聲脫氣。

1.3.4 建立數學模型

食品中維生素C的計算公式為

式中：X為試樣中維生素C的含量，mg/100 g；c為由標準曲線得到的維生素C的濃度，μg·mL-1；V為定容體積，mL；F為稀釋倍數；M為試樣質量，g。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源

不確定度來源主要有4類：①標準溶液配制引入的不確定度urel(S)；②標準曲線校準引入的不確定度urel(c)；③樣品前處理過程中引入的不確定度urel(P)；④實驗結果的重復性測量引入的不確定度urel(A)。

2.2 標準溶液配制引入的不確定度urel(S)

2.2.1 標準物質純度（外標）引入的不確定度

抗壞血酸稱樣量為10 mg，純度為99.76%，不確定度為0.35%，置信區間95%，按均勻分布，k=2，則相對標準不確定度為

2.2.2 標準儲備液配制（外標）引入的不確定度

準確稱量10 mg標準物質溶液于10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，混勻，得1.00 mg·mL-1的標準儲備液。

（1）萬分之一天平引入的不確定度。天平的稱量誤差為0.1 mg[3]，按均勻分布，則標準不確定度為相對標準不確定度為

（2）10 mL容 量 瓶（A級 ） 的 允 差 為±0.020 mL[4]，按均勻分布，則標準不確定度為相對標準不確定度為

（3）10 mL容量瓶（A級）定容因實驗室溫度變化引起溶劑體積變化的不確定度。水膨脹系數（20 ℃）為 0.000 21 ℃-1，溫度變化為（20±5）℃，則標準不確定度為相對標準不確定度為

標準儲備液配制的合成相對標準不確定度為

2.2.3 標準工作曲線配制引入的不確定度

用 100.00 μL 移液器吸取 1.00 mg·mL-1標準儲備溶液0.10 mL、0.05 mL、0.02 mL、0.01 mL，標準中間液體0.10 mL于不同的1.00 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，得到 100.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、20.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1系列標準工作溶液，水的膨脹系數為0.000 21 ℃-1，按照均勻分布，量器及溫度的波動引入的不確定度見表1。

表1 量器及溫度的波動引入的不確定度

標準工作曲線配制的合成相對標準不確定度為

綜上，標準溶液配制的合成相對標準不確定度為

2.3 標準曲線擬合引入的不確定度urel(c)

對標準系列工作溶液進行測定，重復測定3次，以質量濃度對其峰面積通過曲線擬合得到標準曲線，線性回歸方程為y=33.853c-14.02，相關系數為1.0。測定結果見表2。

表2 標準系列工作溶液峰面積測定結果

選取含有維生素C的樣品重復測定6次，根據峰面積帶入線性方程校正其含量，結果見表3。測得樣品中維生素C含量為c0=64.81 μg·mL-1，標準曲線的擬合引入的標準不確定度計算按公式（3），相對標準不確定度計算按公式（4）。

式中：s為標準曲線溶液的峰面積殘差的標準差；k為線性方程斜率，k=33.853；b為線性方程截距，b=-14.02；n為樣品平行測定次數，n=6；p為標準工作溶液各濃度點重復測定的次數，每個濃度點重復測定3次，p=15；c0為樣品溶液中維生素C的平均質量濃度，c0=64.81 μg·mL-1；為標準工作溶液質量濃度的平均值，

標準曲線擬合的樣品中維生素C濃度及平均樣品維生素C濃度計算結果見表3。經計算，標準曲線的擬合引入的標準不確定度u(c)為 0.002 2 μg·mL-1，相對標準不確定度urel(c)為3.592×10-5。

表3 標準曲線擬合的樣品濃度及平均樣品濃度計算結果

2.4 樣品的前處理過程引入的不確定度urel(P)

2.4.1 稱樣引入不確定度

稱取1.00 g試樣（精確至0.001 g），根據《電子天平檢定規程》（JJG 1036—2008），最大允許誤差為±0.005 g[3]，符合矩形分布則相對標準不確定度為

2.4.2 樣品定容引入的不確定度

樣品前處理過程為稱樣，用偏磷酸溶解試樣并定容至50 mL，從中取2 mL用于試樣溶液的還原反應，最終用水定容至50 mL。根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006），50 mL單標線容量瓶（A級）容量允差為±0.05 mL，2 mL分度吸量管容量允差為±0.015 mL[4]，查得20 ℃時水溶液的體積膨脹系數0.000 21 ℃-1，服從矩形分布則50 mL單標線容量瓶容量允差的相對標準不確定度水溶液體積膨脹的相對標準不確定度2 mL分度 吸 量管容量允差的相對標準不確定度水溶液體積膨脹的相對標準不確定度為

因此，樣品定容過程引入的相對標準不確定度為

綜上，樣品前處理引入的相對標準不確定度為

2.5 測量重復性引入的不確定度urel(A)

選取含有維生素C的樣品同時稱取6份，按照前處理方法處理樣品，計算6次重復性結果和平均值。測定結果分別為8.13 g/100 g、8.09 g/100 g、8.10 g/100 g、8.09 g/100 g、8.09 g/100 g和8.11 g/100 g，平均值為8.10 g/100 g，相對標準不確定度計算公式為

經計算，測量重復性引入的相對標準不確定度urel(A)=0.026 1。

2.6 分析過程中不確定度分量及合成相對標準不確定度urel(X)

對葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量分析過程中不確定度進行分析和計算，過程中各相對標準不確定度來源、類型和數值見表4。

表4 不確定度分量

葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量分析過程中的合成相對標準不確定度為

2.7 擴展不確定度

依 據 JJF 1135—2005， 其 置 信 水 平 為95%，k=2，葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量的平均值為8.10 g/100 g，則擴展不確定度為

2.8 測量結果及不確定度報告

高效液相色譜法測定葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量，根據不確定度評定結果，當稱樣量為1 g，置信度為95%（k=2），測定結果為（8.10±0.565）g/100 g。

3 結論

本文對使用高效液相色譜法測定葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量的不確定度進行了分析與評定，高效液相色譜法測定葡萄籽維生素C加E片中維生素C含量的不確定度主要來源于實驗結果的重復性測量和標準溶液配制。因此，在配制標準溶液時要選擇精密度高的計量器具，保證標準溶液配制的準確度，提高實驗結果的準確性[5]。