基于GC-IMS技術(shù)分析留蘭香薄荷及其飼喂草魚的揮發(fā)性組分

楊文麗， 王江龍， 張浩宇， 張昆明， 賈毅男， 俞曉燕， 張光弟*，3，

（1.寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；4.寧夏設(shè)施園藝（寧夏大學(xué)）技術(shù)創(chuàng)新中心，寧夏 銀川 750021）

留蘭香薄荷（Mentha spicata L.）是一種唇形科薄荷屬直立多年生草本植物[1]，原產(chǎn)歐洲，20世紀(jì)80年代初從美國引入我國，目前在河南、浙江等省份有較廣泛栽培[2-3]。留蘭香薄荷是一種藥食兼用的芳香植物，通常作為草藥、茶食用，具有抗敗血癥、抗炎、抗氧化和抗菌活性等作用；其嫩莖、葉為主要食用部分，富含鈣、磷、鐵等多種微量元素和維生素，可用于泡茶、涼拌，味道清涼爽口，可清熱解毒，深受人們的青睞，是一種開發(fā)前景很好的特色芳香植物[4-7]。由于薄荷葉強(qiáng)烈的香氣，薄荷葉可做調(diào)味香料食用，是重要的天然香料之一，自古以來被用于醫(yī)藥行業(yè)[8-9]。留蘭香薄荷精油是以留蘭香植物的花、莖和葉片為原料的揮發(fā)性成分的富集物，具有涼爽、清新和香甜的氣味[10]，其中葉片揮發(fā)油出油率為0.45%，莖揮發(fā)油出油率為0.2%，被廣泛應(yīng)用于食品、制藥和化妝品等行業(yè)[11-13]。 王中華等[14-15]研究表明，留蘭香薄荷莖葉粉含有多種有機(jī)酸和有利于提高機(jī)體免疫功能的黃酮類化合物，提油后的留蘭香植物材料仍殘留醇類、酮類、酯類等揮發(fā)性活性物質(zhì)，這些成分能促進(jìn)腸道腺體分泌、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、促進(jìn)動物的食欲和提高采食量、優(yōu)化營養(yǎng)物質(zhì)的利用與代謝。

草魚（Ctenopharyngodon idellus），是鯉科雅羅魚亞科草魚屬，與鰱、鳙和青魚并稱為“四大家魚”[16]，是中國主要的淡水魚類養(yǎng)殖對象之一，由于長期生長在池塘或湖泊中，不可避免地帶有土腥味等異味，令消費(fèi)者不易接受[17]。近年來，由于草魚養(yǎng)殖在產(chǎn)量不斷增加的同時普遍出現(xiàn)了肉質(zhì)下降的現(xiàn)象[18]，隨著人們生活水平的提高，魚肉消費(fèi)的需求已從數(shù)量型轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)量型[19]，這對草魚養(yǎng)殖品質(zhì)改善提出了新的要求。魚肉的肉質(zhì)通常會被外部環(huán)境因素所影響，如投喂機(jī)制、飼料的組成等均可以影響到肌肉的組織結(jié)構(gòu)、代謝等[20]。目前已有將薄荷作為飼料添加劑應(yīng)用到尖吻鱸的相關(guān)報道，結(jié)果表明薄荷具有促進(jìn)魚類生長、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率、影響血液生化指標(biāo)和細(xì)菌總數(shù)的作用[21]。同時根據(jù)薄荷在中獸醫(yī)理論及國外畜禽上使用的研究，結(jié)合薄荷的藥理作用，將藥食同源薄荷屬植物應(yīng)用到水產(chǎn)品養(yǎng)殖生產(chǎn)中，通過調(diào)整投喂機(jī)制、飼料（餌）組成來改善魚肉的肉質(zhì)風(fēng)味[22]，從而達(dá)到品質(zhì)提升，使其對開發(fā)更具特色的水產(chǎn)品具有一定的價值。這也符合胡建平[23]在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用中草藥替代化學(xué)合成藥物，解決化學(xué)藥物、抗生素等引發(fā)的病原菌抗（耐）藥性和養(yǎng)殖魚類藥物殘留超標(biāo)等問題。

魚-菜共生系統(tǒng)作為新型的循環(huán)水養(yǎng)殖模式，以生態(tài)循環(huán)為特點(diǎn)，以資源互補(bǔ)互利為思路，實(shí)現(xiàn)“魚肥水—菜凈水—水養(yǎng)魚”的和諧共生關(guān)系[24]，生態(tài)環(huán)保優(yōu)勢明顯，通過產(chǎn)出魚、菜兩種作物以提高氮素的回收率，并且可以通過自身凈化水體減少廢水排放，體高水的利用率。鄒藝娜等[25]研究表明，投入系統(tǒng)的餌料中氮素以氨氮的形式排出魚體外后，在微生物作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮及硝酸鹽氮，進(jìn)一步被植物吸收利用，提高了氮的利用效率。本魚-花（薄荷）共生閉環(huán)系統(tǒng)利用薄荷發(fā)達(dá)的根系及其生長時對氮和磷需求較高等特性，在養(yǎng)殖時形成“魚肥水—薄荷凈水—水養(yǎng)魚”的生態(tài)循環(huán)系統(tǒng)，達(dá)到魚-花（薄荷）和諧共生的理想狀態(tài)。

氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)（Gas chromadography-ion mobilidy specdromedry，GCIMS）是一種將離子遷移譜技術(shù)和氣相色譜技術(shù)兩者結(jié)合的檢測技術(shù)，具有檢測速度快、操作方法簡便、設(shè)備便攜等優(yōu)點(diǎn)，是一種方便的食品風(fēng)味化學(xué)分析工具[26-27]，目前已廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析、品質(zhì)檢測等多個領(lǐng)域。和傳統(tǒng)的GC-MS相比，GCIMS儀器無需真空，樣品無需富集濃縮且不會對樣品基質(zhì)產(chǎn)生破壞及分析的溫度更低，一些熱穩(wěn)定性較差的揮發(fā)性物質(zhì)能夠更真實(shí)地被檢出。通過直接頂空進(jìn)樣的方式GC-IMS可快速檢測被測樣品中的VOCs，在食品的風(fēng)味分析中具有較大的應(yīng)用潛力[28-30]，常用于鑒別樣品的真?zhèn)巍⑿迈r度、貨架期、品種品質(zhì)[31]等方面。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試留蘭香薄荷、薄荷飼喂草魚、對照草魚均來自寧夏賀蘭縣光明漁村科海漁業(yè)試驗(yàn)基地。留蘭香薄荷為魚-花（薄荷）共生閉環(huán)系統(tǒng)中浮板直插后5~6月齡樣品，于2019年7月進(jìn)行采集，同時把莖與葉片分樣后保藏在-18℃冰箱備用。薄荷飼喂草魚的方法是按魚體質(zhì)量的10%將新鮮的薄荷莖和葉片剪碎，從2019年9月開始，每天上午09：00、下午16：00分兩次在投喂常規(guī)飼料前進(jìn)行飼喂，對照草魚只投喂常規(guī)飼料。薄荷飼喂草魚、對照草魚于2019年11月中旬隨機(jī)從養(yǎng)殖池塘取平均體質(zhì)量為（785.0±4.5）g的樣品魚各3條，保藏在-18℃冰箱備用。

Flavour Spec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀：德國G.A.S公司產(chǎn)品；AL204型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品處理

-18℃留蘭香薄荷經(jīng)常溫解凍，分別稱取剪碎的薄荷葉片與莖各1 g混合，置于20 mL頂空瓶中，70℃孵育20 min后進(jìn)行樣品測定，每個樣品平行測定3次。-18℃保存的薄荷飼喂草魚和對照草魚各3條，經(jīng)常溫解凍去鱗去皮后取背部肌肉組織去刺粉碎，分別稱取3 g混合，置于20 mL頂空瓶中，45℃孵育20 min后進(jìn)行樣品測定，每個樣品平行測定3次。

1.3 樣品的分析條件

1.3.1 薄荷的分析條件

1）氣相色譜-離子遷移譜條件 分析時間為45 min，色譜柱類型為FS-SE-54-CB-1（15 m×0.68 mm×0.53 mm），色譜柱溫度為60℃，載氣為高純度氮?dú)猓兌取?9.999%），IMS探測器溫度為45℃。

2）自動頂空進(jìn)樣條件 頂空孵育溫度為70℃，孵育時間為20 min，進(jìn)樣體積為2 000 μL（不分流模式），加熱方式為振蕩加熱，進(jìn)樣針溫度為85℃，孵育轉(zhuǎn)速為500 r/min。

3）氣相色譜條件 漂移氣流量（E1）：150 mL/min。氣相載氣流量程序設(shè)定為（E2）：0~2 min，2 mL/min；2~10 min，從2 mL/min上升到10 mL/min；10~20 min，從10 mL/min急速上升到100 mL/min；20~25 min，從100 mL/min上升到150 mL/min；然后流速保持為150 mL/min至分析結(jié)束。

1.3.2 薄荷飼喂草魚與對照草魚的分析條件

1）氣相色譜-離子遷移譜條件 分析時間為30 min，色譜柱類型為FS-SE-54-CB-1（15 m×0.68 mm×0.53 mm），色譜柱溫度為40℃，載氣為高純氮?dú)猓兌取?9.999%），IMS探測器溫度為45℃。

2）自動頂空進(jìn)樣條件 頂空孵育溫度為45℃，孵育時間為20 min，進(jìn)樣體積為5 000 μL（不分流模式），加熱方式為振蕩加熱，進(jìn)樣針溫度為85℃，孵育轉(zhuǎn)速為500 r/min。

3）氣相色譜條件 漂移氣流量（E1）：150 mL/min。氣相載氣流量程序設(shè)定為（E2）：0~2 min，2 mL/min；2~10 min，從2 mL/min上升到10 mL/min；10~20 min，從10 mL/min急速上升到100 mL/min；20~30 min，從100 mL/min上升到150 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過LAV（Laboratory analytical viewer）軟件的Gallery Plot插件，來繪制留蘭香薄荷和薄荷飼魚草魚與對照草魚的GC-IMS指紋圖譜。利用LAV軟件進(jìn)行薄荷飼喂草魚與對照草魚VOCs的差異圖譜分析。采用GC-IMS Library Serach軟件通過內(nèi)置的2014年NIST氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫及IMS數(shù)據(jù)庫對檢測到的VOCs進(jìn)行定性分析，其中定性是通過保留指數(shù)和遷移時間二維定性，兩個都需要匹配；保留指數(shù)是采用和檢測樣品一樣的方法，進(jìn)樣1 mg/L的C4~C9的正構(gòu)酮混合物（保留指數(shù)通過查詢NIST已知），然后建立正構(gòu)酮的保留指數(shù)和保留時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后讀取樣品中目標(biāo)化合物的保留時間，通過上述方程可以計算該物質(zhì)的保留指數(shù)。采用儀器插件Dynamic PCA進(jìn)行動態(tài)主成分分析，采用Microsoft Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 留蘭香薄荷莖和葉片揮發(fā)性有機(jī)物的指紋圖譜差異特征與定性分析

2.1.1 指紋圖譜差異特征采用Flavour Spec?系統(tǒng)自帶的LAV軟件內(nèi)置的Gallery Plot插件框選所有VOCs組分信號峰，對留蘭香薄荷指紋圖譜進(jìn)行分析。由圖1可知，在留蘭香薄荷葉片與莖中共可檢測到VOCs 129種，分別為醇類、酮類、酯類、醛類、硫類、雜環(huán)類和萜烯類，主要為醇類、酮類和醛類，其中醇類物質(zhì)含量相對較高，且其在葉片中含量更高。葉片中的2-乙基呋喃、2-庚酮、苯甲醛、α-蒎烯、異丁酸乙酯、反式-2-己烯醇、芳樟醇和3-辛醇等的含量遠(yuǎn)大于莖，且2-乙酰基呋喃、正己醛、異丁酸乙酯、1-戊醇、丁醛、乙醇、異戊醛等是在葉片中獨(dú)有的。僅有少量物質(zhì)在莖中的含量更高或獨(dú)有，而壬醛、2-甲基丁酸甲酯和3-辛酮等在莖中的含量遠(yuǎn)高于葉片。

圖1 留蘭香薄荷葉片與莖揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜比較Fig.1 Comparison of fingerprint of volatile components in leaves and stems of Mentha spicata L.

2.1.2 定性分析通過GC-IMS Library Serach軟件，根據(jù)氣相色譜的保留指數(shù)（RI）、保留時間（RT）和IMS遷移時間（DT）對其進(jìn)行定性分析，用2014年NIST氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫資料檢索鑒定化合物，在留蘭香薄荷的葉片與莖中共可定性檢出30種揮發(fā)性有機(jī)物，其中醇類化合物9種，占30.00%；酮類化合物7種，占23.33%；酯類化合物4種，占13.33%；醛類化合物5種，占16.67%；硫類化合物2種，占6.67%；雜環(huán)類化合物2種，占6.67%；萜烯類化合物1種，占3.33%。由此可知，留蘭香薄荷葉片與莖的主要揮發(fā)性成分為醇類、酮類、醛類和酯類化合物等組分，且以醇類化合物含量相對最高（見表1）。

表1 留蘭香薄荷葉片與莖揮發(fā)性有機(jī)物定性物質(zhì)Table 1 Qualitative constituents of volatile components in leaves and stems of spearmint

2.2 薄荷飼喂草魚與對照草魚的揮發(fā)性有機(jī)物二維譜圖、指紋圖譜差異特征、定性分析及PCA分析

2.2.1 二維譜圖分析利用GC-IMS對薄荷飼喂草魚與對照草魚魚肉進(jìn)行檢測，分別檢測到相應(yīng)的VOCs。通過機(jī)載LAV分析軟件Reporter插件制作二維譜圖（見圖2），可直觀看出被檢樣品中VOCs在色譜圖上的分布，以及同一組分的RIP（Reaction ionpeak，經(jīng)歸一化處理的反應(yīng)離子峰）、RT及DT特點(diǎn)。大部分信號出現(xiàn)在離子遷移時間、保留時間分別為1.0~1.5 ms和100~700 s的區(qū)域，通過對比圖BH-CY、CK-CY中的A、B、C、D區(qū)域可明顯看出，在薄荷飼喂草魚中含有一些比較明顯的特征峰，這些特征峰所代表的薄荷飼喂草魚與對照草魚VOCs組分在后續(xù)的PCA分析中進(jìn)行進(jìn)一步分析，整個譜圖代表了樣品的全部頂空成分。

圖2 薄荷飼喂草魚與對照草魚氣相離子遷移譜圖差異分析Fig.2 Difference analysis of gas phase ion mobility spectra between mint feeding and control grass carp

續(xù)表1

2.2.2 指紋圖譜差異特征根據(jù)機(jī)載的Gallery Plot插件制作了薄荷飼喂草魚與對照草魚的指紋圖譜。由圖3可知，在薄荷飼喂草魚與對照草魚中共能檢測到VOCs 83種。指紋圖譜已直觀展示兩個樣品間VOCs差異，從圖中A、B區(qū)域可明顯看出，在薄荷飼喂草魚中雙戊烯、順式-3-辛烯-1-醇、苯乙醇、芳樟醇、α-松油醇含量較高，其中芳樟醇、α-松油醇具有抗氧化活性和體外抗菌活性[32]，在圖的C、D區(qū)域，庚酸乙酯、戊醛、羥基丙酮、2-正戊基呋喃、2-甲基丁酸、反式-2-戊烯醛、1-壬醇等在薄荷飼喂草魚中的含量較低。

圖3 薄荷飼喂草魚與對照草魚揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜比較Fig.3 Comparison of volatile component fingerprints between grass carp fed with mint and control

2.2.3 定性分析根據(jù)氣相色譜的保留指數(shù)（RI）、保留時間（RT）和IMS遷移時間（DT）對VOCs進(jìn)行定性分析（見表2），在薄荷飼喂草魚與對照草魚中共可定性出45種VOCs。表中為樣品中所有已鑒定的物質(zhì)，化合物的屬性包括名稱、保留指數(shù)、保留時間、遷移時間、氣味特征以及相對峰體積。其中醇類11種，占24.44%；醛類9種，占20.00%；酯類5種，占11.11%；酮類4種，占8.89%；萜烯類4種，占8.89%；雜環(huán)類4種，占8.89%；硫醚類4種，占8.89%；酸類2種，占4.44%；酚類2種，占4.44%。由此可知，被檢樣品的主要VOCs為醇類、醛類和酯類等組分，且以醇類物質(zhì)含量相對最高。

由表1和表2可知，通過薄荷飼喂草魚后檢測到的具有木香、花香的芳樟醇及蘋果香、桃子香的異戊醛，其在薄荷飼喂草魚中的含量分別為對照草魚的7.3倍和1.6倍；具有果香的2-甲基丁酸乙酯和豆香及麥芽香的2-乙基呋喃的含量分別低于對照草魚；青果實(shí)香的反式-2-己烯醇以及杏仁香、堅果香、水果香的苯甲醛在薄荷飼喂草魚和對照草魚中的含量變化不大。結(jié)合圖3和表2可知，具有蔥香的烯丙基腈，魚腥味、堅果香的庚醛，溶劑味的丙醛，果香味、青草味的2-己烯醛，煙熏、草藥味的對甲酚，花果香的氧化芳樟醇，果香、杏仁香的苯乙酮，蘋果香、桃子香的異戊醛在薄荷飼喂草魚中的含量已高于對照草魚。薄荷飼喂草魚中具有生土豆味的糠醛和苯酚味（臭味、燃燒味）的鄰甲酚等含量較對照草魚有所降低。

表2 薄荷飼喂草魚與對照草魚揮發(fā)性有機(jī)物定性物質(zhì)Table 2 Qualitative analysis of volatile components from mint feeding and control grass carp

續(xù)表2

2.2.4 PCA分析主成分分析是一種多元統(tǒng)計分析技術(shù)，通過確定幾個主成分因子來表示原始樣本中許多復(fù)雜且難以發(fā)現(xiàn)的變量，然后根據(jù)主成分因子在不同樣本中的貢獻(xiàn)率大小來評價樣本之間的規(guī)律性和差異性[33]。本研究以選取的特征峰所對應(yīng)的峰強(qiáng)度值作為特征參數(shù)變量，選取第1、3主成分進(jìn)行可視化分析（紅色和深綠色分別代表薄荷飼喂草魚與對照草魚），結(jié)果如圖4所示。第1主成分PC-1的貢獻(xiàn)率為58%，第3主成分PC-3的貢獻(xiàn)率為31%，二者的貢獻(xiàn)率之和為89%，說明基于VOCs含量的差異，PCA可以將薄荷飼喂草魚與對照草魚進(jìn)行有效區(qū)分，也表明采用芳香食用型花卉植物薄荷定向飼喂方式可以明顯改變草魚魚肉中的雙戊烯、順式-3-辛烯-1醇、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、鄰甲酚、反式-2-戊烯醛等VOCs含量，干預(yù)產(chǎn)品風(fēng)味。這與Nortvedt等[34]研究結(jié)果相似，飼料的組成成分會對肉的風(fēng)味產(chǎn)生影響。

圖4 薄荷飼喂與對照草魚揮發(fā)性組分的PCA分析Fig.4 PCA analysis of volatile components between mint feeding and control grass carps

3 結(jié)語

通過采用GC-IMS對留蘭香薄荷、薄荷飼喂草魚的VOCs分析發(fā)現(xiàn)，留蘭香薄荷、薄荷飼喂草魚VOCs種類構(gòu)成主要包括醛類、醇類、酮類、酯類等。通過指紋圖譜特征分析得出，在留蘭香薄荷葉片與莖中共檢測到VOCs 129種，根據(jù)氣相色譜的保留指數(shù)（RI）、保留時間（RT）和離子遷移時間（DT），通過數(shù)據(jù)庫定性出30種，說明被檢樣品的主要VOCs以醇類、酮類和醛類為主，并以醇類物質(zhì)含量相對最高，且其在葉片中含量更多。葉片中乙醇、正己醇、異丁酸乙酯、丁醛、正己醛和α-蒎烯的含量分別是 莖 的13.80、32.03、13.87、18.62、32.03、13.35倍，說明葉片對薄荷飼喂草魚中VOCs含量的影響明顯。留蘭香薄荷飼喂草魚與對照草魚共檢測到VOCs 83種，定性出45種，其中，雙戊烯、順式-3-辛烯-1-醇、苯乙醇、芳樟醇、α-松油醇在薄荷飼喂草魚中含量較高，同時在薄荷中檢測到的具有木香、花香的芳樟醇及蘋果香、桃子香的異戊醛在薄荷飼喂草魚中的含量分別為對照草魚的7.3倍和1.6倍，說明薄荷中物質(zhì)轉(zhuǎn)移至草魚中明顯。

通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，薄荷飼喂草魚與對照草魚之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異顯著，可以各自聚為一類；同時，薄荷飼喂降低了對照草魚中具有苯酚味（臭味、燃燒味）的鄰甲酚和海水味、腥臭味的反式-2-戊烯醛兩種令人不愉快的氣味物質(zhì)，說明將具有抗微生物、抗氧化、抗真菌和抗炎活性等作用的薄荷屬植物應(yīng)用到草魚飼喂生產(chǎn)中是可行的，能達(dá)到改變草魚揮發(fā)性風(fēng)味的作用。

作者采用GC-IMS對魚-花（薄荷）共生閉環(huán)系統(tǒng)中的留蘭香薄荷及其飼喂草魚VOCs的變化情況進(jìn)行分析，旨在為留蘭香薄荷在藥食同源、精準(zhǔn)加工及特色水產(chǎn)品養(yǎng)殖生產(chǎn)中的高效利用提供參考，同時為進(jìn)一步獲取高品質(zhì)的草魚產(chǎn)品提供理論依據(jù)。