基于磁性共價有機骨架對烤肉中苯并[a]芘的檢測

楊念慈， 楊 成， 龐月紅

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

多 環(huán) 芳 烴 （Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一類具有多個稠環(huán)的持久性有機污染物[1]，大多具有“三致效應”，即致癌性、致畸性和致突變性[2-4]。食物經(jīng)過不適當?shù)呐胝{(diào)方式如熏制、油炸和燒烤等，都會產(chǎn)生大量PAHs[5]，通過食物攝入對人體健康造成威脅[6]。苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene，BaP）作為PAHs中致癌性最強的一種，已被國際癌癥研究機構列為Ⅰ級致癌物[7]。BaP在環(huán)境中相對穩(wěn)定、難以降解，含量又與PAHs總量相關，所以常用作評估多環(huán)芳烴暴露總量的指示物。我國在《食品安全國家標準食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中對肉及肉制品（熏、烤、烤肉）中BaP的最大限量為5.0 μg/kg[8]。

常用的BaP檢測方法是將樣品提取后，使用中性氧化鋁柱或分子印跡固相萃取柱凈化，高效液相色譜儀進行定性定量分析。然而傳統(tǒng)的柱層析法和固相萃取法存在易堵塞、高背壓和解吸不完全等問題，且成本較高、難以再生利用。近年來，國內(nèi)外致力于樣品前處理技術的改進。磁固相萃取法（Magnetic solid phase extraction，MSPE）是在固相萃取基礎上發(fā)展起來的一種前處理技術，與傳統(tǒng)固相萃取相比，MSPE不需要填柱，也避免了固相萃取柱易堵塞和高背壓等問題[9-10]。MSPE吸附劑可以很好地分散到樣品萃取液中，與目標物充分接觸，并通過外加磁場實現(xiàn)快速分離的目的，具有萃取時間短、操作簡單等優(yōu)點。

共價有機骨架 （Covalent organic frameworks，COFs）是由C、N、O、B等元素通過共價鍵連接的新型多孔納米材料，具有大的比表面積、良好的化學和熱穩(wěn)定性、可調(diào)的多孔結構和π共軛體系等性質，已廣泛應用于樣品前處理中[11-13]。BaP是分子直徑約為1.1 nm的芳香族化合物，而COF-DQTP的孔徑為23?且具有大的π共軛體系。COF-DQTP與BaP之間的π-π共軛作用和孔徑匹配應，使得COF-DQTP有望作為吸附劑應用于BaP的富集檢測中。

作者采用共沉淀法快速簡便地合成了磁性共價有機骨架（Fe3O4/COF-DQTP），作為MSPE的吸附劑，結合高效液相色譜-熒光檢測器（HPLC-FLD）檢測，建立一種BaP的檢測方法（MSPE-HPLC-FLD方法），并成功應用到烤肉（烤魚、烤羊肉和烤牛肉）中BaP的檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑

實驗所有的試劑均為分析純及以上純度。苯并[a]芘標準品（質量分數(shù)96%）：上海阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品；1，2，3-三醛基間苯三酚（TP）、2，6-二氨基蒽醌（DAAQ）：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；N，N-二甲基乙酰胺（DMA）、乙酸水溶液（體積分數(shù)36%）、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、硫酸亞鐵七水合物（FeSO4·7H2O）、氯化鐵六水合物（FeCl3·6H2O）、氨水：中國國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、乙醇（均為色譜級）：賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水儀（18.2 MΩ·cm）：美國默克密理公司產(chǎn)品。

1.2 儀器及色譜測定條件

IS10傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀（400~4 000 cm-1）：美國Nicolet公司產(chǎn)品；JEM 2100F透射電子顯微鏡（TEM）：日本電子JROL公司產(chǎn)品；e2695高效液相色譜儀（配備2475 FLR熒光檢測器）用于苯并[a]芘的分離檢測）、ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國沃特世科技有限公司產(chǎn)品。

流動相：乙腈-水（體積比80︰20），等度洗脫，流速為1.5 mL/min。進樣體積為10 μL。熒光檢測器：激發(fā)波長為369.0 nm，發(fā)射波長為404.0 nm。單個樣品檢測時間為20.0 min，BaP在11.7 min處出峰。

1.3 Fe3O4/COF-DQTP的制備

參照文獻[14-15]合成COF-DQTP。將34.0 mg（0.142 mmol）的2，6-二氨基蒽醌（DAAQ）和20 mg（0.096 mmol）的1，2，3-三醛基間苯三酚（TP）溶解在1 mL N，N-二甲基乙酰胺中，并加入50 μL乙酸（6 mol/L）作為催化劑。超聲混勻后，將獲得的混合物轉移到襯有特氟隆的高壓釜中，并在363 K下加熱48 h。獲得產(chǎn)物分別用N，N-二甲基乙酰胺、超純水、乙醇和丙酮離心洗滌多次，直到上清液顏色變?yōu)橥该鳎ノ捶磻呐潴w和溶劑，獲得深紅色產(chǎn)物COF-DQTP。最后，將合成的COF-DQTP在60℃下真空干燥過夜，機械研磨后備用。采用共沉淀法制備Fe3O4/COF-DQTP。制備步驟如下：將70 mg COF-DQTP、0.5 g Fe3O4·7H2O和0.8 g FeCl3·6H2O分散在200 mL超純水中，超聲處理后，將上述懸浮液加熱到80℃并充分攪拌，逐滴加入氨水將pH調(diào)節(jié)至10，懸浮液會迅速從黃色變?yōu)楹谏谠摐囟认卤３謹嚢锠顟B(tài)30 min；冷卻至室溫，獲得的黑紅色固體Fe3O4/COF-DQTP可以在外加磁場的作用下收集，然后用超純水和乙醇洗滌，在60℃下真空干燥過夜。

1.4 樣品收集及處理

未烤制過的生豬、牛、羊肉購于江南大學附近的超市，烤魚、烤牛肉、烤羊肉樣品購于江南大學附近的烤肉店。將樣品經(jīng)過絞肉機均質化，準確稱取3.0 g樣品置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈超聲處理20 min；再將樣品經(jīng)過10 000 r/min離心10 min，收集上清液，將樣品殘渣再加入15 mL乙腈進行提取；再次重復上述超聲和離心操作，合并兩次上清液，過濾處理后，放入冰箱備用。

1.5 磁固相萃取實驗

首先，將30 mg Fe3O4/COF-DQTP磁性吸附劑加到30 mL BaP標準溶液或樣品提取液中，在室溫下?lián)u床振蕩20 min后，通過磁力分離Fe3O4/COFDQTP吸附劑和上清液，棄上清液；再用5 mL乙腈解吸兩次，每次用搖床勻速振蕩10 min，使用磁鐵分離吸附劑和洗脫液，合并兩次的洗脫液，并用0.22 μm濾膜過濾去除雜質，最后通過HPLC-FLD測定BaP的含量。

2 結果與討論

2.1 磁固相萃取-高效液相色譜法的建立

Fe3O4/COF-DQTP磁性材料對烤肉中苯并[a]芘的檢測方案如圖1所示。首先將烤肉樣品均質，用乙腈進行超聲輔助提取，離心取上清液，重復提取步驟以保證對樣品的充分提取，過濾得到澄清透明的烤肉提取液。Fe3O4/COF-DQTP磁性材料對烤肉提取液中BaP進行萃取，磁力分離去上清液，徹底除去樣品基質和雜質。然后加入解吸溶劑將吸附在磁性材料上的BaP洗脫下來，收集解吸液，進入HPLC-FLD進行定量分析。

圖1 磁固相萃取-高效液相色譜法檢測烤肉中BaP方案Fig.1 Schematic diagram for magnetic solid phase extraction method for BaP detection in roast meat

2.2 表征

通過FT-IR表征COF-DQTP和Fe3O4/COFDQTP的結構信息。從圖2可 知，COF-DQTP在1 569 cm-1和1 251 cm-1處有很強的特征峰，分別對應著C=C和C—N拉伸，這說明合成過程中發(fā)生了烯醇結構到酮式結構的轉變，表明COF-DQTP合成成功。在Fe3O4/COF-DQTP的譜圖中，除了C=C和C—N拉伸，還觀察到585 cm-1處的吸收，對應于Fe—O—Fe的振動峰，說明成功合成了Fe3O4/COFDQTP。

圖2 DQTP、Fe3O4和Fe3O4/COF-DQTP的FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectra of COF-DQTP,Fe3O4 and Fe3O4/COF-DQTP

從低倍數(shù)的透射電子顯微鏡（TEM）圖像中可以看出，合成的Fe3O4/COF-DQTP大多呈球形，顆粒分布較為均勻，如圖3（a）所示。從高倍數(shù)的TEM圖像中可估算Fe3O4/COF-DQTP的平均粒徑為20 nm，如圖3（b）所示。吸附劑顆粒分布均勻和較小的 粒徑有利于萃取的進行。

圖3 Fe3O4/COF-DQTP的TEM圖像Fig.3 TEM images of Fe3O4/COF-DQTP

2.3 條件優(yōu)化

2.3.1 吸附劑用量的優(yōu)化分別探究了5、10、20、30、40 mg的Fe3O4/COF-DQTP萃取30 mL 20 μg/L的BaP標準溶液的效果。由圖4可以看出，當Fe3O4/COF-DQTP質量在5~30 mg時，峰面積隨著吸附劑質量的增加而增大，當吸附劑質量大于30 mg時，峰面積不再有明顯的增加，表明Fe3O4/COF-DQTP質量在30mg時即可達到較好的萃取效果，因此選擇30 mg作為實驗的吸附劑質量，即吸附劑用量為1 mg/mL。

圖4 Fe3O4/COF-DQTP吸附劑用量對萃取效果的影響Fig.4 Effect of the amount of Fe3O4/COF-DQTP adsorbent

2.3.2 解吸溶劑的優(yōu)化解吸溶劑決定了目標物是否能從吸附劑上完全洗脫，所以解吸溶劑的選擇是十分重要的。對比了甲醇、乙醇和乙腈3種有機溶劑的解吸效果后，結果顯示乙腈解吸效果遠優(yōu)于甲醇和乙醇（見圖5）。此外，根據(jù)BaP的溶解性，也考察了固相萃取法常用的洗脫劑，如甲苯、正己烷以及二氯甲烷的解吸效果，發(fā)現(xiàn)Fe3O4/COF-DQTP在這3種溶劑中不能很好地分散，這對吸附、解吸以及磁分離過程都造成阻礙。因此，最終選擇乙腈作為解吸溶劑。

圖5 解吸溶劑對萃取效果的影響Fig.5 Effect of the eluents

2.3.3 萃取時間的優(yōu)化萃取時間對萃取效果具有雙重影響，時間過短使得萃取不充分，時間過長會延長實驗時間。因此，研究了萃取5、10、20、30、40 min對萃取效果的影響。如圖6所示，F(xiàn)e3O4/COFDQTP對BaP的萃取可以在20 min內(nèi)達到最大的峰面積，所以選擇20 min作為萃取時間。萃取時間在20~40 min峰面積不升反而有所下降，猜測吸附在20 min之前就已經(jīng)達到平衡，而吸附時間越長，BaP與吸附劑之間的結合越緊密，也就越難解吸。

圖6 萃取時間對萃取效果的影響Fig.6 Effect of the extraction times

2.3.4 解吸時間的優(yōu)化解吸時間是影響解吸效果的主要條件之一，解吸時間過短會導致解吸不充分，使得解吸效果不佳。在2~20 min優(yōu)化了解吸時間對解吸效果的影響，由圖7可以看出，在短時間內(nèi)（5 min）就可以達到很好的解吸效果，峰面積隨著時間的增加而增加；但在10 min后，峰面積隨著時間增加有小幅度的增加，峰面積在統(tǒng)計學上沒有顯著性的差異，所以選擇10 min作為最佳的解吸時間。

圖7 解吸時間對萃取效果的影響Fig.7 Effect of the desorption times

2.3.5 解吸體積的優(yōu)化如圖8所示，考察了解吸體積為5、10、10（2×5，等體積解析兩次）、15、20 mL的解吸效果。理論上，解吸體積越小富集倍數(shù)越大，也可減少溶劑的使用，但同時解吸效果也有所減弱。在相同的解吸體積下，多次解吸效果優(yōu)于一次解吸，用5 mL乙腈解吸2次的解析率就大于1次10 mL乙腈解吸。所以選擇解吸效果最好的10（2×5）mL作為解吸體積和解吸方式用于之后的實驗。

圖8 解吸體積對萃取效果的影響Fig.8 Effect of the desorption volume

2.4 方法學研究

將制備的Fe3O4/COF-DQTP磁性材料作為磁固相萃取的吸附劑，與高效液相色譜聯(lián)用，建立了一種檢測烤肉中BaP的方法。在最優(yōu)條件（即吸附劑用量為1 mg/mL、乙腈作為解吸溶劑、萃取時間為20 min、解吸時間為10 min、解吸體積為10（2×5）mL）下，建立的MSPE-HPLC-FLD方法在BaP質量濃度為0.5~100.0 μg/L條件下，峰面積與BaP質量濃度呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）為0.999 8，擬合線性回歸方程為y=41 099x+10 670，檢出限（S/N=3）為0.14 μg/L，定量限（S/N=10）為0.47 μg/L，日內(nèi)和日間相對標準偏差分別為3.5%（n=5）和3.9%（n=5），如圖9所示。

圖9 Fe3O4/COF-DQTP萃取不同質量濃度BaP的色譜圖及峰面積與BaP質量濃度的標準曲線Fig.9 Chromatograms of Fe3O4/COF-DQTP extracting BaP with different concentrations and calibration plot of peak areas versus BaP concentrations

2.5 方法比較

經(jīng)過文獻調(diào)研，將已報道的BaP檢測方法和本文中建立的磁固相萃取法相比較。為了更加全面進行對比，列舉了各方法的前處理方法、樣品基質、分析方法、檢出限、線性范圍等參數(shù)（見表1）。結果顯示，建立的MSPE-HPLC-FLD方法與文獻報道方法具有相當?shù)臋z出限和定量限，較寬的線性范圍，這可能與磁COF材料與BaP之間具有較強的π-π共軛作用和孔徑效應有關。

表1 文獻方法與本文建立方法對比Table 1 Comparison of the proposed method with the previous works

2.6 實際樣品

為驗證方法的準確性和適用性，將所建立的MSPE-HPLC-FLD方法用于富集和檢測烤肉中的BaP，樣品中以10.0、20.0、30.0 ng/g 3個水平加入BaP標準物，并計算其在不同種類烤肉中的加標回收率。結果如表2所示，在3種烤肉樣品（烤魚、烤牛肉和烤羊肉）中均有BaP檢出，根據(jù)基質磁固相萃取法所擬合的線性方程，換算可得到質量分數(shù)分別 為19.5、17.3、16.0 ng/g，均 超 過 國 家 標 準GB 2762—2017所規(guī)定的肉及制品中BaP的限量5.0 μg/kg。加標回收實驗結果顯示，烤魚的加標回收率為110.8%~123.4%，烤牛肉的回收率為92.6%~101.0%，烤羊肉的回收率為76.0%~111.3%，相對標準偏差≤10.6%。

表2 不同烤肉樣品的檢測結果及加標回收率結果Table 2 Analytical results of different roast meat samples and recoveries of BaP in three spiked level

3 結語

采用共沉淀法成功合成了磁性共價有機骨架Fe3O4/COF-DQTP，并將其作為MSPE的吸附劑，結合HPLC-FLD檢測，建立了一種BaP檢測的新方法。所建立的方法具有較寬的線性范圍，良好的檢出限和定量限，并成功應用到烤肉樣品中的BaP檢測中。