超聲處理輔助大豆分離蛋白改善蛋黃乳化性

畢雅雯， 劉 晶， 蔣 艷， 涂勇剛， 董世建， 徐明生*

（1.江西農業大學 江西省農產品加工與質量控制工程實驗室，江西 南昌 330045；2.安徽榮達食品有限公司，安徽 宣城 242228）

蛋黃具有很高的營養價值和功能特性，其質量約占雞蛋總質量的28%~29%。蛋黃含有蛋黃卵磷脂、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、卵黃高磷蛋白、卵黃蛋白等表面活性成分，并且具有很強的天然乳化性，對油脂和水有很強的親和力，是制造焙烤食品、乳飲料及冰激凌時起乳化作用的重要配料[1]。但是蛋黃的乳化性會受其加工方法的影響，如降低蛋黃濃度可導致乳液的乳化性下降，乳液易分層或析油，對產品的外觀及保質期易造成不良影響，限制了蛋黃乳液在實際生產中的應用[2]。因此，改善蛋黃乳化性具有重要的意義。

研究表明，蛋黃蛋白對乳化性的貢獻高于磷脂，針對蛋白質改性來提升蛋黃乳液的乳化性是研究熱點。如秦鳳嬌等[3]發現磷酸鹽作用于蛋黃后，蛋黃的電負性增強，油滴間的靜電排斥作用提高，乳液的穩定性得到改善；Xu等[4]使用辛烯基琥珀酸酐（OSA）淀粉破壞了蛋黃蛋白聚集體，提高了油水界面的吸附率以達到穩定蛋黃乳液的作用；Yan等[5]采用高靜水壓力誘導蛋黃蛋白展開，使其更易吸附于油水界面，改善了蛋黃的乳化性。近年來，由于蛋白質具有兩親性，能夠擴散和吸附到油水界面上，形成穩定的界面蛋白膜，而被廣泛用作乳化劑，增強乳液的乳化性[6]。而SPI是一種由大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白組成的剛性球狀蛋白，具有良好的乳化性，主要作為加工助劑用于乳液中[7]。如大豆分離蛋白作用于乳清分離蛋白，發現復合物的乳化性相比單一的乳清分離蛋白得到更好改善，且乳液的粒徑更小，靜電排斥力更強[8]。除乳化劑影響乳液的乳化性外，超聲功率也是影響乳液乳化性的重要因素。超聲波改變蛋白質乳化性主要通過聲空化效應形成局部極端物理力，引起食品系統中的一些物化性質和微觀結構變化[9]。如Xie等[10]通過超聲處理蛋黃使蛋黃低密度脂蛋白部分聚集，蛋白質分子結構拉伸和局部構象變化，提高了蛋黃乳液的乳化性；王喜波等[11]利用超聲波改變大豆分離蛋白-乳清蛋白乳液的乳化性和結構，發現超聲處理輔助大豆分離蛋白，可以進一步改善乳清蛋白的乳化性，使乳液具有更大的表面電荷和更小的粒徑，形成更穩定的乳液。但是有關SPI改善蛋黃乳液乳化性以及SPI輔以超聲處理改善蛋黃乳液乳化性的影響尚不清楚。

作者以新鮮蛋黃為原料，研究SPI對蛋黃乳化性的影響，并在此基礎上進一步研究不同超聲功率對EY-SPI乳化性的影響，為改善蛋黃乳液類產品的生產及應用提供一定理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋：市售；SPI（食品級，純度>98%）：臨汐山松生物制品有限公司產品；尼羅紅：美國Sigma試劑公司產品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

超微聲波細胞粉碎儀：寧波新藝有限公司產品；Zetasizer Nano ZS90粒子分析儀：美國Malvern公司產品；T25分散機：德國IKA公司產品；OLYMPUS倒置熒光顯微鏡：奧林巴斯（深圳）工業有限公司產品；高速冷凍離心機：上海安亭儀器公司產品；V-5600型可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 乳液的制備將1 g的SPI、EY、EY-SPI粉末分別溶于99 g的去離子水中，25℃下磁力攪拌2 h，使其充分溶解，放置過夜，將EY、SPI、EY-SPI溶液和大豆油按體積比7∶3混合，10 000 r/min下高速剪切2 min，得到EY、SPI和EY-SPI乳液。

1.3.2 超聲處理分別采用0、150、300、450 W的超聲功率，將制備好的EY、SPI、EY-SPI乳液處理8 min。在超聲波處理整個過程中，將溫度控制在25～35℃。

1.3.3 乳化活性與乳化穩定性的測定參考Xie等[12]的方法，略做修改。從底部吸取50 μL乳液，與5 mL的0.1 g/dL SDS溶液混合，用可見分光光度計在波長500 nm處測定吸光度。乳化活性（EAI）和乳化穩定性（ESI）的計算公式如下：

式中：A0為勻漿后的吸光度；N為稀釋因子，100；C為樣品的質量濃度，mg/mL；F為原油乳狀液的體積分數（0.25）；A10為10 min后乳液的吸光度。每個樣品測量并重復3次。

1.3.4 乳析指數的測定將未超聲和超聲處理的乳液放置在密封管中，25℃保存14 d，每天測量乳液的乳化量。乳析指數的計算公式如下：

式中：H為乳析指數，%；Hc為底部透明液層高度，cm；He為總乳液高度，cm。

1.3.5 粒徑的測定參考文獻[13]的方法，略做修改。分散介質的折射率為1.330，吸收指數為0.001，分散液滴的折射率為1.456。測定前，用PBS溶液將乳液稀釋250倍，以避免多次散射。對每個記錄進行10多次掃描，每個樣本進行3次測量。

1.3.6 Zeta電位的測定參考文獻[14]的方法，略做修改。乳液的Zeta電位是根據激光多普勒電泳遷移率理論，在25℃下使用粒子分析儀測定，每個樣本測量3次。乳液在測定前，用PBS溶液稀釋2 000倍。對每條記錄進行15次以上掃描，每個樣本進行3次測量。

1.3.7 溶解度的測定參考文獻[15]的方法，略做修改。準確稱取30 g樣品溶液，使用高速冷凍離心機在4℃條件下以10 000 r/min離心30 min。離心后，取上清液用BCA蛋白質定量法在562 nm處測定蛋白質質量濃度。溶液中總蛋白質含量通過凱氏定氮法測定。可溶性蛋白質的溶解度通過以下公式計算：

式中：C為可溶性蛋白質的溶解度，%；C1為上清液中蛋白質含量；C2為蛋黃中總蛋白質含量。

1.3.8 界面蛋白吸附量的測定參考文獻[16]的方法，略做修改。取新鮮乳液30 mL于50 mL離心管中，10 000 r/min轉速下離心30 min，乳液被分為上層乳析相和下層水相。將離心管在-40℃下冷凍8 h，固定上下相，然后使用刀片將上層乳析相去掉，剩余的下層水相使用0.22 μm濾膜過濾，采用凱氏定氮法測定蛋白質質量分數。界面蛋白吸附量按照下式進行計算：

式中：K為界面蛋白吸附量，g/g；M為乳液中總蛋白質質量，g；M1為下層水相蛋白質質量，g；M2為乳液中油的質量，g。

1.3.9 SDS-PAGE電泳分析參考文獻[17]的方法，略做修改。取新鮮乳液30 mL于50 mL離心管中，10 000 r/min轉速下離心30 min，乳液被分為上層乳析相和下層水相。將離心管在-40℃下冷凍8 h以固定上下相，將上下相分離。取約1 g上層乳析相（界面蛋白），質量濃度調整為2 mg/mL，進行煮沸。采用體積分數5%濃縮膠（80 V）和體積分數12%分離膠（120 V）進行電泳分析。

1.3.10 微觀結構的測定參考文獻[18]的方法，略做修改。采用熒光顯微鏡觀察新鮮乳液的形態，將40 μL尼羅紅染料加入至2 mL乳液中，進行染色，拍攝圖片。

1.3.11 數據統計與分析所有的樣品進行3次測定，計算平均值。使用Origin 8.0和Excel 2013分析所有數據。使用SPSS 19.0進行方差分析，顯著性分析采用Duncan多重比較法。

2 結果與分析

2.1 乳化活性與乳化穩定性

如圖1所示，在EY中添加SPI，可以顯著提高EY的乳化活性和乳化穩定性（P<0.05），表明在蛋黃中添加SPI可顯著改善蛋黃的乳化活性和乳化穩定性。超聲處理后EY、SPI、EY-SPI的乳化活性和乳化穩定性顯著提高（P<0.05）；當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的乳化穩定性最好（P<0.05），表明適當的超聲功率可以輔助SPI顯著改善蛋黃的乳化穩定性（P<0.05）；隨著超聲功率的增強，乳液的乳化穩定性降低。超聲功率超過150 W后超聲功率對EY-SPI的乳化活性影響不顯著。Zhang等[19]研究發現乳清蛋白作用于SPI，WPI-SPI復合物的界面蛋白吸附量增加和油滴間的靜電排斥力增強，乳液的乳化穩定性提高，所以EY-SPI乳液的乳化穩定性增強也有可能是由于油水界面的吸附量和表面電荷分布發生變化所引起的。超聲處理后，通過聲空化效應產生的物理力，乳液的粒徑減小，進一步改善其乳化活性和乳化穩定性；而150 W的超聲功率可以改變EY-SPI在油水界面的分布，從而顯著提高EY-SPI的乳化穩定性[20]；但在超聲處理過程中，顆粒的破碎和重聚同時發生，超聲功率過高時，蛋白質之間重聚現象出現，所以乳液的乳化穩定性在一定程度上下降[21]。

圖1 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI乳化特性Fig.1 Emulsification characteristics of EY，SPI and EYSPI under different ultrasonic power

2.2 乳液的乳析指數

為了進一步考察乳液的乳化穩定性，測定了第1天和第14天乳液的乳析指數和外觀圖。乳液貯存1 d的外觀圖和乳析指數見圖2（a）、（b），EY-SPI乳液的乳析指數顯著低于EY和SPI乳液（P<0.05），表明EY-SPI乳液中，液滴之間的斥力作用強度高于EY、SPI乳液，液滴才有規則地分布并緊密堆積使乳脂層加厚，乳析指數降低[22]。超聲處理后乳液的乳析指數顯著降低（P<0.05），該變化趨勢與乳液的乳化穩定性變化相反，表明超聲處理可以顯著改善乳液的乳化穩定性（P<0.05），但是隨著超聲功率的增強，乳液的乳析指數未發生顯著性變化，具體原因還需進一步研究。

乳液貯存14 d的外觀圖和乳析指數如圖2（c）、（d）所示，SPI、EY-SPI乳液的乳析指數顯著高于EY乳液（P<0.05），可能是因為隨著貯存時間的延長，SPI、EY-SPI乳液中的蛋白質開始聚集，界面蛋白吸附量減少，乳液的乳脂層厚度較小，乳析指數增加。超聲處理后，乳液的乳析指數顯著減小（P<0.05），當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液未發生相分離，乳析指數為0，乳液最穩定，說明超聲處理可以輔助SPI顯著提高蛋黃的乳化穩定性（P<0.05），該結果與2.1中乳化穩定性的研究一致。

圖2 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI乳析指數Fig.2 Emulsification index of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.3 乳液的粒徑

乳液粒徑大小對乳液的穩定性有很大的影響，一般乳滴的直徑越小，乳液的穩定性越強。乳液的粒徑變化如圖3所示，EY-SPI乳液的粒徑顯著高于EY和SPI乳液（P<0.05），表明在蛋黃液中添加SPI，EY-SPI乳液中可能產生蛋白質聚集體。超聲處理后乳液粒徑顯著減小（P<0.05），當超聲功率為150 W，EY-SPI乳液的粒徑最小（P<0.05），說明適當的超聲功率可以顯著減小乳液的粒徑（P<0.05），使蛋黃乳液達到穩定的狀態；隨著超聲功率的增強，SPI、EY-SPI乳液的粒徑增大，EY乳液的粒徑減小。超聲處理后，由于超聲的聲空化效應，產生了湍流和高剪切力，加劇了油滴的破裂，從而使乳液的粒徑減小[23]；而150 W的超聲處理使得EY-SPI中蛋白質更容易吸附在乳液表面，蛋白質之間產生空間位阻作用，抑制了EY-SPI乳液液滴之間的相互作用，進一步減小乳液的粒徑[24]；但是高強度的超聲功率可以產生較大湍流力和微流體，增加碰撞和聚集的速度，導致蛋白質聚集體的形成，使乳液的粒徑增大[25]。

圖3 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI粒徑Fig.3 Particle size of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.4 乳液的微觀結構

微觀結構是表征乳液顆粒大小、分散性、不穩定性的指標。如圖4所示，采用倒置熒光顯微鏡對其微觀結構進行分析，綠色熒光代表油脂。超聲功率為0 W時，乳液的液滴尺寸較大，聚集情況嚴重。而經過超聲處理后，乳液的液滴尺寸顯著減小，液滴呈規律的球形狀態，少有聚集情況；當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的液滴尺寸最小且分布均勻。表明超聲處理可以減小乳液的粒徑大小，并且包裹油滴的界面蛋白之間產生較強的空間阻力，形成規則的球形[26]；150 W的超聲處理使EY-SPI蛋白在油水界面形成更加致密的膜結構，減少了液滴的聚集。

圖4 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI微觀結構Fig.4 Microstructure of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.5 乳液的界面蛋白吸附量

界面蛋白的吸附能力對乳液聚集穩定有重要影響。如圖5所示，EY-SPI乳液的界面蛋白吸附量顯著高于EY、SPI乳液（P<0.05），表明EY、SPI等質量混合，可以使乳液的界面蛋白吸附量增加。超聲處理后乳液的界面蛋白吸附量顯著提高（P<0.05），當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的界面蛋白吸附量顯著高于EY乳液（P<0.05）。隨著超聲功率的增強，乳液的界面蛋白吸附量降低。EY-SPI乳液界面蛋白吸附量增加可能是由于加入SPI，更多的蛋白質吸附于油水界面，油滴被更好的包裹，防止了油滴的聚集和絮凝，提高了乳液的穩定性[27]；由于超聲處理使蛋白質顆粒減小，更易吸附于油水界面，乳液的界面蛋白吸附量增加；150 W的超聲功率可以使更多的EY-SPI蛋白吸附于油水界面，增強了液滴之間的靜電排斥力，從而使EY-SPI乳液的乳化穩定性提高。超聲功率超過150 W時，乳液的界面蛋白吸附量開始下降，可能是由于過高的超聲功率使蛋白質發生自聚集行為，在油水界面的伸展吸附作用減弱[28]。

圖5 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI界面蛋白吸附量Fig.5 Interfacial protein adsorption capacity of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.6 乳液的界面蛋白組成

蛋黃乳液主要由蛋白質形成并進行穩定，而不同蛋白質穩定乳液的能力也有所差異[29]，為此利用SDS-PAGE電泳分析乳液的界面蛋白組成變化情況。由于各組界面蛋白均稀釋了同樣的倍數，條帶的深淺一定程度代表其界面蛋白含量的高低，條帶的數量代表界面蛋白的種類。如圖6所示，泳道5~8為EY界面蛋白條帶，主要是低密度脂蛋白（相對分子質量分別為2.20×105、1.10×105~1.80×105和5.00×104）以及卵黃球蛋白（3.8×104~4.0×104）。泳道9~12為SPI界面蛋白條帶。與泳道5~8相比，泳道1~4 EY-SPI出現了一些新條帶，主要是3.4×104和1.5×104，這些新增條帶與泳道9~12的條帶基本一致，說明添加SPI后，EY-SPI乳液中的蛋白質共同吸附于油水界面，使EY-SPI乳液的界面蛋白的吸附量顯著高于EY乳液。隨著超聲功率的增強，乳液條帶顏色加深，表明超聲處理可以使更多的蛋白質吸附于油水界面，乳液的乳脂層加厚，乳液液滴的靜電排斥力增強，乳化穩定性提高[30]。

圖6 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI界面組成Fig.6 Interface composition of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.7 乳液的Zeta電位

通過測量乳液Zeta電位，研究了靜電作用對蛋白質乳液穩定性的影響。如圖7所示，EY-SPI乳液的Zeta電位顯著高于EY乳液（P<0.05），表明在蛋黃液中添加SPI可顯著增強蛋黃的靜電排斥力。超聲處理后乳液的Zeta電位顯著提高（P<0.05），當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的靜電排斥力最強（P<0.05）。EY-SPI乳液的Zeta電位比EY乳液的高，可能是由于SPI的加入，使更多的蛋白質吸附到乳液液滴表面，增大了油滴的表面電荷，增強了液滴間的排斥力，提高了乳液的穩定性[31]。超聲處理后，EY-SPI乳液的Zeta電位增大可能是由于超聲處理使蛋白質折疊分解，暴露了更多的親水基團，增強了表面電荷密度，增大了乳滴之間的靜電排斥力，提高了乳液的穩定性[32]，而適當的超聲功率可以使更多的蛋白質吸附于油水界面，形成較厚的乳脂層，增強液滴間的靜電排斥力。

圖7 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI電位Fig.7 Electric potential of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

2.8 蛋白質的溶解度

蛋白質的溶解度是影響乳液性質的一個重要因素。一般認為，蛋白質的溶解度較大時，蛋白質在溶液或者兩相界面發揮的作用較大，乳化性較好。如圖8所示，EY-SPI乳液的蛋白質溶解度顯著高于EY乳液（P<0.05），表明在蛋黃液中添加SPI可顯著增強蛋黃蛋白的親水性。超聲處理后乳液的蛋白質溶解度顯著提高（P<0.05），當超聲功率為150 W時，EY-SPI乳液的蛋白質溶解度最高（P<0.05）。蛋白質溶解度的增加可歸因于超聲處理降低了EY-SPI的粒徑，增強了蛋白質與水的相互作用，從而增加了蛋白質的溶解度[33]；也可能是由于蛋黃蛋白分子在超聲作用中部分展開，變得更易溶解，更易與SPI發生相互作用，在乳化過程中能夠快速吸附到油水界面，形成穩定的乳狀液[34]。

圖8 不同超聲功率的EY、SPI、EY-SPI溶液中蛋白質溶解度Fig.8 Solubility of EY，SPI and EY-SPI under different ultrasonic power

3 結語

添加SPI后，EY乳液的Zeta電位增大，界面蛋白吸附量提高，有效改善了EY的乳化性。而當150 W超聲功率作用于EY-SPI乳液時，蛋白質聚集體破碎，形成了小的可溶性蛋白質聚集物，在乳化過程中迅速吸附在油水界面，形成了較厚的界面蛋白膜，提高了靜電排斥力，乳液粒徑最小，分布均一，乳液更穩定。