基于比色和熒光雙信號檢測戊唑醇的免疫層析試紙條的構建

趙 赟， 蔡伊娜， 張存政， 彭池方*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3.深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045；4.江蘇省農業科學院，江蘇 南京 210014）

戊唑醇（Tebuconazole，TEB）是一種廣譜、高效、低毒且藥效持續時間長的新型三唑類殺菌劑[1]，在農業生產中應用廣泛，可以控制蔬菜、水果和谷物的病原真菌，以保證農產品的產量和質量。然而，殺菌劑的濫用存在巨大的危害，如對人體健康的潛在危害以及農產品、土壤和水中的殘留對環境造成污染[2]。盡管已經有許多方法可實現TEB的高靈敏度檢測，如高效液相色譜法[3]和氣相色譜法[4]等，但是這些方法存在儀器昂貴、檢測煩瑣、耗時和要求專業人員等限制，使其難以實現TEB的現場檢測。因此，開發高靈敏、低成本的戊唑醇檢測方法具有重要意義。

免疫層析技術（Lateral flow immunoassay，LFIA）是一種基于色譜層析技術和納米標記物[5]的即時檢測技術。目前，基于納米材料的改性或修飾是提高LFIA檢測性能的重要途徑之一[6]。例如多巴胺（Dopamine，DA）作為一種穩定的功能化修飾材料受到廣泛關注。Xu等[7]使用H2O2輔助DA氧化聚合為聚多巴胺（Polydopamine，PDA），成功在金納米顆粒（Gold nanoparticles，AuNPs）表面修飾不同厚度的PDA殼層，提高了與玉米烯酮抗體偶聯的穩定性和檢測靈敏度。Choi等[8]在堿性條件下使DA自聚合到AuNPs表面，并利用PDA良好的黏附性，將熒光標記的發夾DNA鏈固定在表面。Liu等[9]通過將PDA修飾到AuNPs表面，成功將CuInZnS量子點結合在該復合材料表面，AuNPs-PDA核殼結構不僅增強了電化學發光強度，而且大大削減了熒光淬滅的程度。量子點（Quant dot，QD）具有穩定性強，熒光發射強度高和發射波長可調等優點，常被作為標記物來提高LFIA的靈敏度和穩定性[10]。例如高曉龍等[11]將羧基化CdSe/ZnS量子點與犬細小病毒單克隆抗體5G7共價偶聯，制備出量子點免疫層析試紙條，其靈敏度達到1×103TCID50/mL，顯著高于傳統膠體金試紙條。Sheng等[12]根據ZnCdSe/ZnS量子點的淬滅機理，將代表陽性的消線信號轉換為顯線信號，顯著提高了四環素類抗生素檢測的裸眼檢出靈敏度。

本研究中通過H2O2輔助制備Au@PDA，并以Au@PDA為熒光淬滅體，以噴涂在T線上的ZnCdSe/ZnS量子點作為熒光供體，構建了一種基于反向熒光增強的雙信號放大免疫層析模型，實現了對戊唑醇的快速半定量檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯金酸、卵清蛋白、多巴胺鹽酸鹽（DA·HCl）、檸檬酸三鈉：上海國藥控股化學試劑有限公司產品；戊唑醇：Sigma公司產品；表面羧基化ZnCdSe/ZnS量子點：世紀珈源量子點技術有限公司產品；戊唑醇單克隆抗體：作者所在實驗室制備；實驗用水均為18.2 MΩ·cm的Millipore超純水，其余試劑均為市售分析純。

ZQ2000微電腦自動斬切機：上海金標生物科技有限公司產品；GT-710手持式食品安全分析儀：北京勤邦生物技術有限公司產品；紫外分光光度計：江蘇貝普科學儀器有限公司產品；WH220-R磁力攪拌器：北京維根技術有限公司產品；ZX1000三維噴點平臺：上海百道貿易有限公司產品；臺式高速冷凍離心機：中國賽默飛世爾科技有限公司產品。

1.2 AuNPs和Au@PDA的合成

參照文獻[13]中制備方法。將實驗所用的三角瓶、攪拌子用重鉻酸和濃硫酸混合液浸泡過夜，然后用蒸餾水反復沖洗，再用超純水漂洗，烘干待用；準確量取99.5 mL的超純水于三角瓶中，加入500 μL質量分數2%的氯金酸溶液，攪拌均勻后加熱；待溶液沸騰后一次性加入5 mL的1 g/dL檸檬酸三鈉，繼續加熱至溶液顏色變為酒紅色，當溶液顏色穩定時，停止加熱，慢速攪拌30 min后取下，自然冷卻至室溫后存放到4℃冰箱保存待用。

參考文獻[14]中合成方法，稍做改動。取1 mL制備好的AuNPs溶液，10 000 r/min離心30 min，并使用Tris-HCl（pH 9）重懸，加入4 μL體積分數為3% H2O2充分攪拌均勻，分別加入10、20、30 μL 5 mg/mL DA·HCl（分別記為Au@PDA-50、Au@PDA-100、Au@PDA-150），室溫下避光反應1 h，待溶液由酒紅色變為紅褐色后10 000 r/min離心30 min，并加入超純水復溶，放置4℃冰箱待用。

1.3 Au@PDA-mab的制備

取1 mL上述制備得到的Au@PDA溶液，使用0.1 mol/L的K2CO3調節pH至7，置于磁力攪拌器上并緩緩加入7 μg戊唑醇單克隆抗體；避光反應1 h后加入10 μL質量分數20%BSA封閉30 min，封閉完成后10 000 r/min離心30 min，去除上清液后加入100 μL超純水復溶。

1.4 量子點-卵清蛋白（QDs-OVA）的合成

參照文獻[15]中偶聯方法，稍做改動。具體如下：取100 μL表面羧基化ZnCdSe/ZnS量子點（8 μmol/L），以50 mmol/L的硼酸緩沖液（pH 6）稀釋至600 nmol/L，加入0.1 mol/L的K2CO3調節pH至5~6，慢速攪拌條件下加入15 μL 10 mg/mL EDC溶液，室溫下避光反應4 h；隨后加入1.8 mg卵清蛋白，繼續反應過夜至反應結束后置于4℃儲存。

1.5 免疫層析試紙條的組裝

免疫層析試紙條主要由樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、聚氯乙烯底板（PVC底板）和吸水墊5部分組成（見圖1）。將玻璃纖維膜裁成長度15 mm的長條作為樣品墊，經處理液浸泡后37℃烘干。將玻璃纖維膜切成長度6 mm的長條作為金標墊，并使用處理液浸泡后37℃烘干。將Au@PDA-mab探針噴涂在金標墊于37℃烘箱烘干30 min后備用。將吸水墊裁成長度10 mm的長條，按圖1所示將各部分組裝完畢。使用劃膜機將包被原和量子點-卵清蛋白復合物的混合物噴涂在NC膜上作檢測線（T線），將羊抗小鼠二抗噴涂在NC膜上作為控制線（C線），兩線間距6 mm。烘干后，使用自動斬切機裁成長度4 mm的長條，置于37℃下烘干6 h后裝入含有干燥劑的封口袋中待用。

圖1 雙信號免疫層析試紙條的結構示意圖Fig.1 Schematic illustration of immunochromatographic test strip

1.6 反應條件的優化

基于雙信號讀取模式，先對Au@PDA裸眼比色模式的條件進行優化，以T線顏色的色差為指標，對PDA層厚度、pH、抗體加入體積和包被原（TEBBSA）質量濃度進行條件優化；隨后，在紫外光照射條件下，繼續對量子點濃度和探針體積作為優化條件，以熒光恢復最小濃度為優化指標，得出最佳參數。

式中：ΔPPI為在陽性條件下和陰性條件下，試紙條上T線讀取到的信號的差值；PPI0為在陰性條件下檢測時，T線條帶的像素分辨率；PPI1為在陽性條件下檢測時，T線條帶的像素分辨率

2 結果與討論

2.1 AuNPs和Au@PDA的表征

如圖2所示，通過DA聚合反應，在AuNPs表面可形成均勻的殼層。殼層的厚度隨著DA加入量的增加而增加，并且，其吸光度也有顯著增加（見圖3），這有利于試紙條比色信號的增強。DA對AuNPs的包裹，是由于DA在堿性條件下很容易氧化自聚合形成PDA，并且具有非常強的黏附作用[16]，而這源于其表面含有豐富的3，4-二羥基-L-苯丙氨酸（DOPA）和賴氨酸[17]。并且，上述Au@PDA對抗體的結合也不同于傳統膠體金通過靜電吸附標記抗體，而是通過PDA借助表面較強的奎寧-氨基作用，以及邁克爾加成反應[18]，使得與抗體偶聯更加穩定。

圖2 AuNPs和Au@PDA的TEM圖Fig.2 TEM images of AuNPs and Au@PDA

圖3 AuNPs/Au@PDA和QD的紫外吸收光譜和熒光光譜Fig.3 UV-vis and fluorescence spectra of AuNPs/Au@PDA and QD

表面羧基化的量子點通過活潑酯法將卵清蛋白偶聯到量子點表面。當Au@PDA距離QDs-OVA足夠近時，QDs發出的熒光強度將會顯著下降甚至淬滅，這是由于Au@PDA的紫外吸收光譜特征峰和量子點的發射光譜特征峰重疊程度大（見圖3），導致量子點發出的熒光被Au@PDA吸收，即發生了熒光共振能量轉移（FRET）[15]。所設計比色和熒光雙信號檢測試紙條的檢測原理如下：當樣品中不含有戊唑醇時，T線噴涂的包被原捕獲Au@PDA探針，FRET作用下熒光被淬滅，如圖4（a）所示；而當樣品中存在目標物時，競爭作用下結合到T線上的Au@PDA數量減少，熒光逐漸恢復，如圖4（b）所示。

圖4 試紙條熒光檢測的原理Fig.4 Principle of fluorescent detection with LFIA strip

2.2 反應條件的優化

2.2.1 PDA層厚度的影響向1.2中AuNPs溶液里分別加入50、100、150 μg的DA，反應結束后測定紫外吸收峰（見圖3）分別在525、531、537 nm處，且溶液顏色逐漸加深，制備的AuNPs模板特征峰在518 nm處；隨后，從TEM表征中（見圖2）可測出殼層厚度分別為2.0、3.5、4.2 nm，當PDA層厚度為3.5 nm時（DA加入質量100 μg），檢測線的像素值差ΔPPI最高（見圖5）。應用Au@PDA提高了試紙條檢測的信號響應，這可主要歸結于兩方面：一方面PDA修飾金納米顆粒使其比表面積增大，增加納米粒子表面吸附的抗體量；另一方面，所得到的Au@PDA的吸光度增加。因此選用加入質量為100 μg作為DA最佳加入量。

圖5 比色檢測模式條件下PDA層厚度的優化Fig.5 Optimization of thickness of PDA layer in colorimetric detection mode

2.2.2 抗體加入體積的影響當Au@PDA表面標記抗體足夠時，探針才會足夠穩定不至于在鹽溶液中發生聚沉[19]，但過量的抗體不僅會造成抗體的浪費，同時也會降低對戊唑醇的響應。如圖6所示，當抗體加入體積超過10 μL時，ΔPPI逐漸下降，因此選用抗體加入體積10 μL為最優條件。

圖6 比色檢測模式條件下抗體加入量的優化Fig.6 Optimization of amounts of antibody in colorimetric detection mode

2.2.3 pH的影響抗體偶聯標記物的環境是影響抗體標記物效果的重要因素之一，對于靜電吸附而言，pH達到抗體等電點時最適合抗體的標記，但由于PDA與抗體發生的是共價鍵的結合，如圖7所示，可以看到pH為7時ΔPPI最大，隨著pH逐漸升高PPI0逐漸下降，說明邁克爾加成反應不適于在堿性條件下進行，因此，pH為7時是標記抗體的最佳環境。

圖7 比色檢測模式條件下pH的優化Fig.7 Optimization of pH in colorimetric detection mode

2.2.4 包被原質量濃度的影響當T線上包被原質量濃度過高時，T線上就會吸附過多的探針，從而導致陽性檢測時T線信號值響應程度下降。由圖8可以看出，當T線上包被原質量濃度從0.25 mg/mL逐漸增大到1.00 mg/mL時，PPI0逐漸增大，捕獲到的探針數量增多，但ΔPPI在0.50 mg/mL質量濃度條件下達到最高，說明包被原質量濃度在0.5 mg/mL條件下最利于目標物的檢出。

圖8 比色檢測模式條件下TEB-BSA質量濃度的優化Fig.8 Optimization of concentration of TEB-BSA in colorimetric detection mode

2.2.5 量子點和Au@PDA-mab探針負載量的影響在上述優化條件下，選取了3個濃度的量子點和金標墊上不同體積的探針相互作用，如圖9所示，當T線上噴涂量子點濃度為300 nmol/L時，紫外光照射條件下，只能在干燥的條帶上讀取微弱的熒光信號，而當樣品加入后，量子點熒光信號被背景值覆蓋（見圖9（a））；當量子點濃度為900 nmol/L時，紫外光照射條件下能夠清楚的識別出熒光信號，但是隨著探針體積的增多，并不能觀察到熒光淬滅的現象，即使探針最大加入體積達到3 μL依舊無法完全淬滅（見圖9（c））；而當量子點濃度調整為600 nmol/L時，不僅能夠清楚地辨別出T線上的熒光條帶，同時在探針體積加到3 μL時可以觀察到熒光剛好被淬滅，因此3 μL探針體積和600 nmol/L量子點濃度為最適熒光淬滅體積和濃度。

圖9 Au@PDA對量子點淬滅效應的優化Fig.9 Optimization of the quenching effect of Au@PDA toward quantum dots

2.3 試紙條的檢測靈敏度

在上述最優反應條件下，利用Au@PDA對QDs的熒光淬滅作用，將戊唑醇質量濃度的負反饋信號轉換為正反饋信號，結合Au@PDA本身裸眼比色，構建出一種雙信號讀取方法來檢測農藥殘留物戊唑醇。以含有體積分數5%甲醇的PBS緩沖溶液作為溶劑，對戊唑醇標準品梯度稀釋配置一系列質量濃度溶液；兩種信號讀取方式中，均以裸眼能夠觀察到消線或顯線的最小質量濃度作為定性檢測限（見圖10），在裸眼比色條件下，當戊唑醇質量濃度達到1 μg/mL時T線消失，因此1 μg/mL為裸眼比色的檢測限。在紫外光照射條件下，隨著戊唑醇質量濃度的升高熒光強度也逐漸升高，裸眼觀察到T線熒光出現的最小質量濃度為100 ng/mL，因此100 ng/mL為熒光檢測的定性檢測限。以上結果表明，裸眼檢測時，熒光檢測比比色檢測的靈敏度提高了10倍。關于戊唑醇檢測方法的報道較少，如Danks等[20]建立了一種用于定量檢測戊唑醇的競爭性ELISA方法，其最低檢出質量濃度為20 ng/mL。侯世澄等[21]利用戊唑醇對牛血清白蛋白的內源熒光淬滅作用，建立熒光光度法檢測戊唑醇，其檢出限為0.66 μg/mL。由于本方法采用的是肉眼判別結果，考慮到采用層析試紙熒光讀數儀一般可以提高其檢測靈敏度一個數量級左右[11-12]，因此，本方法與上述的戊唑醇檢測的方法對比，其靈敏度、便攜性和操作簡便性都具有一定的優勢。許俊麗等[13]將膠體金探針和樣品溶液在微孔孵育一段時間后，建立基于濕法膠體金免疫層析的戊唑醇檢測方法，對戊唑醇檢測靈敏度達到6.25 ng/mL。盡管本研究中的方法靈敏度低于上述方法，但是本方法基于干法檢測，只需要一步操作，且無需儀器讀取，因此更能體現試紙操作簡單、成本低和靈敏度高等優點。

圖10 試紙條檢測對戊唑醇的靈敏度Fig.10 Sensitivity of detecting tebuconazole

2.4 特異性分析實驗

分別選用10 μg/mL的丙環唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇三唑類殺菌劑和1 μg/mL的戊唑醇作為可能存在的農藥殘留共存物進行特異性實驗。如圖11所示，10 μg/mL的丙環唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇并沒有引起T線上信號的響應，這說明本方法對于戊唑醇的檢測具有良好的特異性。

圖11 試紙條檢測戊唑醇的特異性Fig.11 Specificity of tebuconazole test strip

2.5 實際樣品中的檢測

根據許俊麗等[13]對果蔬的預處理操作，將黃瓜用食品粉碎機打碎成泥漿狀，然后取10 g樣品于50 mL離心管中，然后在渦旋儀上振蕩15 min，并分別加入10 mL乙腈和1~3 g NaCl，振蕩混勻30 min，隨后在5 000 r/min條件下離心5 min使樣品殘渣、水相和有機相分層。準確吸取5 mL上層提取液于10 mL離心管中，氮氣吹干，殘留物加入5 mL緩沖液（體積分數5%甲醇-PBS混合液）復溶后加入戊唑醇標準品使其質量濃度分別為0、50、100、500 ng/mL和1 μg/mL用作試紙條檢測，但首先需要去除基質干擾效應，如表1所示。將基質以兩倍梯度稀釋，結果發現當稀釋倍數為16倍時對試紙條結果讀取沒有影響，基于熒光及比色檢測靈敏度分別為100 ng/mL和1 μg/mL，檢測結果表明添加質量濃度≥100 ng/mL和≥1 μg/mL時，濃縮提取后用體積分數5%甲醇-PBS稀釋16倍時，檢測結果可與緩沖液配制標準液一致。上述結果表明，乙腈提取黃瓜樣品時基質存在較明顯干擾，但是通過緩沖液適當稀釋既可以消除樣品基質對上述試紙條檢測戊唑醇的干擾。上述試紙條的熒光檢測模式，對黃瓜中戊唑醇的定性檢測限為0.8 mg/kg。我國對黃瓜中戊唑醇的殘留限量為1.0 mg/kg，因此，本研究中的試紙條可以滿足監管的要求。

表1 黃瓜中戊唑醇的檢測Table 1 Detection of tebuconazole（TEB）in cucumber

3 結語

本研究中基于Au@PDA抗體復合物以及半導體量子點，成功構建了一種裸眼比色和熒光雙信號檢測戊唑醇試紙條。通過對檢測條件的優化，在熒光檢測模式下，其檢測靈敏度比比色檢測模式提高了10倍，和其他檢測方法相比本研究的方法操作過程簡單、檢測速度快，從而實現了對戊唑醇的高靈敏定性分析。