泥鰍蛋白多肽的抗氧化活性

呂新河， 朱云龍*，2

（1.南京旅游職業學院 烹飪與營養學院，江蘇 南京 211100；2.揚州大學 旅游烹飪學院·食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

泥鰍作為我國極具特色的淡水魚類，具有重要的經濟以及研究價值[1]。泥鰍適應環境能力強且營養豐富[2-3]，近年來得到國內外學者的廣泛關注以及挖掘研究。目前市場上關于泥鰍蛋白產品的開發研究大多聚焦于泥鰍相關的粗加工品，均未能將泥鰍體內的活性成分深度運用[4-6]。在上述背景下，作者以泥鰍為原料，提取蛋白多肽并進行體外抗氧化活性以及體內抗氧化活性研究，為泥鰍蛋白的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泥鰍：購自南京市眾彩批發市場；60只5周齡的（20.0±2.0）g SPF級雌性小鼠：購自常州卡文斯實驗動物有限公司。

堿性蛋白酶（酶活為120 000 U/g）、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒：購自南京建成公司；其余均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA3204電子分析天平：上海邦億精密量儀有限公司產品；723N可見分光光度計：上海佑科儀表有限公司產品；ULT1386-3-V超低溫冰箱：美國REVCO公司產品；ALPHA 1-2LD PLUS凍干機：德國Marin Christ公司產品；L4-6KR低溫離心機：深圳三利儀器有限公司產品；LM纖維超濾裝置：博納機械設備有限公司產品；高壓滅菌鍋：山東博科有限公司產品；SYC恒溫水浴鍋：上海耀特儀器有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 泥鰍蛋白多肽的制備參考高丹丹等[7]的制備方法，并稍做修改。稱取固定質量的樣本，只取樣本的肌肉組織進行均質處理，按料液質量體積比1 g∶40 mL與去離子水混合，混合均勻后，用1 mol/L的NaOH將pH調節至10.0，加入堿性蛋白酶反應（加酶量1 500 U/g）2 h，沸水浴滅酶8 min，水解產物在6 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液并通過可截留相對分子質量為10 000的平板膜，收集相對分子質量小于10 000的酶解液，冷凍干燥24 h后獲得泥鰍蛋白多肽。

1.3.2 體外抗氧化活性研究

1）羥自由基（·OH）清除能力的測定 羥自由基（·OH）清除能力的測定參照李亞會等[8]方法，并在此基礎上稍做改進。將制得的泥鰍蛋白多肽用蒸餾水調制為不同質量濃度蛋白多肽溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。取1.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4·7H2O溶液、1.0 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇、1 mL泥鰍蛋白多肽，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37℃的條件下水浴加熱0.5 h，測定510 nm處的吸光度，記為A1；以蒸餾水替換過氧化氫以及泥鰍蛋白多肽溶液（受測溶液），重復以上實驗，測得吸光度分別記為A2以及A0。按照式（1）計算羥自由基（·OH）清除率I1，以VC作為對照，評價其消除能力，實驗重復3次，并對結果進行統計分析。

2）ABTS自由基清除能力的測定ABTS自由基清除能力的測定參照Yap等[9]方法，并在此基礎上稍做改進。實驗步驟如下：將制得的泥鰍蛋白多肽用蒸餾水調制為不同質量濃度溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。取0.2 mL 7.4 mmol/L ABTS和0.2 mL 2.6 mmol/L K2S2O8，室溫避光環境中混合靜置15 h。取磷酸緩沖溶液（pH 7.4）將混合靜置試劑稀釋50倍作為ABTS工作液。將0.2 mL體積分數95%乙醇溶液與0.8 mL ABTS工作液混合靜置6 min，在734 mm下測定吸光度，記作A10；用受測溶液替換體積分數95%乙醇溶液，重復以上實驗，記為A。按照式（2）計算ABTS自由基清除率I2，以VC作為對照，實驗重復3次，并對結果進行統計分析。

3）DPPH自由基（DPPH·）清除能力的測定DPPH自由基（DPPH·）清除能力的測定參考劉沙等[10]的方法，并稍做修改。實驗步驟如下：將制得的泥鰍蛋白多肽用蒸餾水調制為不同質量濃度溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。量取2.0 mL調配好的泥鰍蛋白多肽溶液與2.0 mL DPPH·乙醇溶液混合，常溫下反應0.5 h，測定517 nm的吸光度，記作A20。取2.0 mL DPPH·乙醇溶液與2.0 mL無水乙醇重復以上步驟，測定吸光度記作Ac。取2.0 mL泥鰍蛋白多肽溶液與2.0 mL無水乙醇溶液重復以上步驟，測定值記作A30。按照式（3）計算DPPH自由基（DPPH·）清除率I3，以VC作為對照，實驗重復3次，并對結果進行統計分析。

1.3.3 體內抗氧化活性研究

1）動物實驗設計 動物實驗設計參考文獻[11~13]實驗方法，并作修改。選取60只5周齡的SPF級雌性小鼠，體質量為（20.0±2.0）g，在溫度20～22℃、濕度40%～60%、明暗交替喂養12 h的條件下進行喂養，適應性喂養7 d后，將實驗所選取的60只小鼠隨機分為以下6組：空白對照組、模型對照組、多肽高劑量組、多肽中劑量組、多肽低劑量組、VC對照組。空白對照組僅每天皮下注射生理鹽水，其余各組小鼠每天頸部皮下注射D-半乳糖（200 mg/kg）；空白對照組和模型對照組每天灌胃0.2 mL 0.9 g/dL生理鹽水；在每天灌胃0.2 mL 0.9 g/dL生理鹽水的基礎上，分別用質量分數為200、400、800 mg/kg的泥鰍蛋白多肽進行灌喂小鼠，分別作為多肽低劑量組、多肽中劑量組和多肽高劑量組；VC對照組每天按300 mg/kg劑量的VC進行灌喂。連續注射、灌胃6周，每周對小鼠進行一次體質量稱量，以調整注射量以及灌胃量。

2）樣品采集 參考文獻[14-16]實驗方法，并作修改。實驗期結束后，禁食不禁水12 h后對小鼠進行眼球取血，在4℃、3 500 r/min條件下離心10 min用于制備血清。對小鼠進行斷頸處死，取出小鼠肝臟以及心臟，清洗干凈后，稱取適量肝臟組織及心臟組織加入生理鹽水，快速制備質量濃度為10 g/mL的組織勻漿，在4℃、3 500 r/min的條件下離心10 min獲取組織上清液。

3）生化指標的測定 小鼠的血清、肝臟及心臟中的SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性測定參考試劑盒說明書。

4）肝臟HE染色切片 參照文獻[17-20]對動物組織切片的處理方法，小鼠肝臟組織取樣后放入固定液中完成固定，肝臟HE染色切片制作由揚州大學醫學院完成。

1.4 數據處理

本實驗中檢測數據以均數±標準差表示，數據分析運用SPSS 19.0軟件。運用Microsoft Excel 2003軟件繪制統計圖。

2 結果與分析

2.1 泥鰍蛋白多肽的體外抗氧化活性研究

2.1.1 泥鰍蛋白多肽對·OH清除能力的影響大量實驗證據表明，體外·OH清除能力的強弱能有效反映抗氧化物抗氧化能力[21-22]。以VC作為對照組，測定不同質量濃度受測溶液對·OH的清除效果，結果見圖1。當受測溶液質量濃度在0.2 mg/mL時，泥鰍蛋白多肽·OH的清除率為33.2%，與VC的·OH的清除率相比差異性顯著；當受測溶液質量濃度高于1.0 mg/mL時，泥鰍蛋白多肽的·OH清除率與0.2 mg/mL受測溶液的清除率相比顯著提升，達到59.6%，與同質量濃度的VC相比，達到了其清除率的64.4%。這說明泥鰍蛋白多肽具有一定的清除·OH的能力。

圖1 泥鰍蛋白多肽對·OH清除能力的影響Fig.1 Scavenging effect of the antioxidant activity of the polypeptidet of the loach extract on·OH

2.1.2 泥鰍蛋白多肽對ABTS自由基清除能力的影響清除ABTS自由基的能力是總抗氧化能力的重要體現[23-25]。以VC作為對照組，測定不同質量濃度受測溶液對ABTS自由基的清除能力，結果見圖2。當受測溶液質量濃度低于0.4 mg/mL時，對ABTS自由基清除率較低且清除率的提升不明顯，其中質量濃度在0.4 mg/mL時對ABTS自由基的清除率為16.3%；當受測溶液質量濃度為0.6 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率出現顯著提高，清除率達到24.9%；當受測溶液質量濃度達到1.0 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率為41.6%。這表明當質量濃度在0.2~1.0 mg/mL時，泥鰍蛋白多肽對ABTS自由基的清除能力與VC相比仍然有限。

圖2 泥鰍蛋白多肽對ABTS自由基清除能力的影響Fig.2 Scavenging effect of the antioxidant activity of polypeptide of the loach extract on ABTS

2.1.3 泥鰍蛋白多肽對DPPH·清除能力的影響DPPH·清除率是衡量抗氧化物質體外抗氧化能力最為重要的指標之一[26-28]。將VC作為對照組，測定不同質量濃度受測溶液對DPPH·的清除效果，結果見圖3。VC的清除率在質量濃度達0.4 mg/mL時，已經開始趨于穩定，并接近于最大清除率；當質量濃度處于1.0 mg/mL時VC的清除率高達91.1%，這說明VC的DPPH·清除率已基本趨于穩定并接近清除率的極限。當受測溶液的質量濃度低于0.2 mg/mL時，DPPH·清除率相對比較低；當達到0.4 mg/mL及以上質量濃度時，受測溶液的DPPH·清除率開始呈現出顯著變化；當受測溶液質量濃度達到1.0 mg/mL時，DPPH·清除率明顯增高（清除率為55.6%），并出現顯著差異。雖然受測溶液與VC相比DPPH·清除率具有顯著的差異性，但實驗結果表明泥鰍蛋白多肽仍具有一定的清除DPPH·的能力。

圖3 泥鰍蛋白多肽對DPPH·清除率的影響Fig.3 Scavenging effect of the antioxidant activity of the polypeptide of the loach extract on DPPH·

2.2 泥鰍蛋白多肽體內抗氧化活性分析

2.2.1 泥鰍蛋白多肽對小鼠血清的影響由表1可得，小鼠血清的測定中空白對照組與模型對照組各指標均存在極顯著差異。SOD活性的測定中，模型對照組與泥鰍蛋白多肽低劑量組之間具有明顯差異（P<0.05），其中與模型對照組相比，多肽低劑量組SOD活性在數值上提升了19.2%；而多肽中劑量組與高劑量組之間的差異并不明顯，在數值與模型對照組相比上分別提升了31.8%和36.6%，這可能是由于泥鰍蛋白多肽對小鼠血清的影響已經基本達到了最大化。結果表明泥鰍蛋白多肽對小鼠血清SOD活性有影響，并且在800 mg/（kg·d）時接近最佳效果。MDA活性測定中，對比模型對照組，泥鰍蛋白多肽中、高劑量組均能夠有效抑制小鼠血清脂質過氧化的發生，其中泥鰍多肽中劑量組對比模型對照組MDA降低了11.4%，具有顯著降低效果；泥鰍多肽高劑量組則降低了16.2%，具有極顯著降低效果。GSH-Px活性的測定中，泥鰍多肽低、中、高劑量組的活性均顯著高于模型對照組（P<0.05），隨著劑量的增加，活性顯著增強。

表1 泥鰍蛋白多肽對小鼠血清的影響Table 1 Loach polypeptide extracts on mice

2.2.2 泥鰍蛋白多肽對小鼠肝臟的影響受測小鼠肝臟中SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性相關結果見表2。肝臟的測定結果中空白對照組與模型對照組各指標均存在顯著差異。SOD活性測定中，模型對照組與多肽低劑量組之間不存在顯著差異（P＞0.05）。在多肽中、高劑量組中可看出隨著泥鰍蛋白多肽質量分數的升高SOD活性出現明顯提升（P<0.01），其中多肽高劑量組與模型對照組相比數值提升了28.1%，說明泥鰍蛋白多肽能夠明顯提升小鼠肝臟中SOD活性，但劑量要達到一定數值。MDA活性測定中，泥鰍蛋白多肽的中、高劑量組數值均明顯低于模型對照組，其中多肽高劑量組有效降低了18.3%，說明泥鰍蛋白多肽能夠顯著的抑制肝臟組織脂質過氧化的發生。與模型對照組相比各劑量組的多肽均能有效提升小鼠肝臟GSH-Px活性，與模型對照組相比較，多肽低、中、高3個劑量組分別提升了40.8%、88.9%、132.2%，并且有很好的劑量效應關系。實驗結果中的泥鰍蛋白多肽高劑量組能夠顯著提升GSH-Px活性。

表2 泥鰍蛋白多肽對小鼠肝臟的影響Table 2 Loach polypeptide on mice with the effect in the liver

2.2.3 泥鰍蛋白多肽對小鼠心臟的影響受測小鼠心臟中SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性相關結果見表3。小鼠心臟的測定結果中空白對照組與模型對照組的各指標均存在顯著差異。SOD活性的測定中，與模型對照組相比，多肽高、中、低3個劑量組均能不同程度地提升SOD活性（分別提升22.3%、12.5%、7.5%），其中多肽中、高劑量組能極顯著提高小鼠心臟組織SOD活性。模型對照組小鼠心臟的MDA水平高于多肽中、高劑量組，多肽中、高劑量組對比模型對照組在MDA水平上分別有效降低了21.1%以及26.2%，這表明泥鰍蛋白多肽能夠在一定程度上減弱心臟組織的脂質過氧化反應帶來的致衰效果。GSH-Px活性的測定中，從多肽低劑量組開始與模型對照組之間呈現出上升趨勢，多肽低、中、高3個不同劑量組數值上分別提升了24.6%、66.9%、92.5%，這表明多肽中、高劑量組能夠有效提升小鼠心臟GSH-Px活性。

表3 泥鰍蛋白多肽對小鼠心臟的影響Table 3 Loach polypeptide on mice with the effect in the heart

2.2.4 泥鰍蛋白多肽對小鼠肝臟組織結構的影響小鼠肝臟組織染色切片（HE染色，200×）如圖4所示。由圖可見，空白對照組中的肝臟細胞肝索排列有序且肝竇大小正常，細胞凋亡情況不明顯。模型對照組中肝竇大小出現異常情況，肝索排列混亂，其中出現了明顯的細胞凋亡現象。不同劑量的泥鰍蛋白多肽組與模型對照組比較可以看出，肝竇擴大的情況趨于減少，肝索隨著劑量的增加趨于正常，細胞凋亡情況有所緩解。這再次表明泥鰍蛋白多肽對減少肝臟因氧化應激而產生的損傷具有一定的作用。

圖4 小鼠肝臟組織切片Fig.4 Histopathology of liver

3 結語

實驗表明，當泥鰍蛋白多肽質量濃度達到1.0 mg/mL時，·OH、ABTS自由基和DPPH·清除率分別達到了59.6%、41.6%以及55.6%。這說明泥鰍蛋白多肽在體外具有有效的清除·OH、ABTS自由基以及DPPH·的能力。體內抗氧化實驗中，多肽高劑量組中血清、肝臟、心臟的SOD活性與模型對照組相比分別提升36.6%、28.1%以及22.3%，GSH-Px活性分別提升43.2%、132.2%以及92.5%，MDA水平分別降低了16.2%、18.3%以及26.2%。實驗說明，泥鰍蛋白多肽具有提高小鼠血清、肝臟以及心臟組織SOD活性和GSH-Px活性，同時能夠抑制小鼠MDA水平的作用。肝臟組織切片表明泥鰍蛋白多肽對小鼠肝臟免受因氧化應激而產生的損傷具有一定效果。本實驗結果對泥鰍蛋白多肽以及其深加工產品提供了參考。