我國部分地區豬產氣莢膜梭菌流行病學調查及毒素型分析

張漢云，馮 琪，藍國文，張 杭，于高博，尚志祥，林瑞慶

（1.廣州市番禺區動物防疫監督所，廣東 廣州 511400；2.華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州 510642）

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringen, Cp），又名魏氏梭菌，溫和厭氧，是革蘭氏陽性產芽孢粗大桿菌，經常單個存在，有時可見偶鏈狀排列[1-3]。Cp可引起人類食物中毒、多種動物壞死性腸炎及腸毒血癥，是一種人畜共患病原菌[4]。Cp在自然界中廣泛分布，常見于土壤、污水、飼料、人和動物的腸道及糞便中，是人和多種動物胃腸道的常在菌群之一，在外界以芽孢存在，抵抗力強[5-7]。Cp主要通過產生毒素導致機體發病，也可以通過在形成芽孢過程中合成孢內腸毒素而致病[5-9]。Cp嚴重影響畜禽的健康，給畜牧養殖業造成了嚴重的經濟損失，同時對人和動物的健康造成了極大的威脅[5]。

產氣莢膜梭菌能產生多種外毒素和侵襲性酶類，根據其產生的4種主要毒素（α、β、ε和ι）[8-10]，Cp可分為A、B、C、D、E 5種類型，除此之外，最新的分類還依據腸毒素（CPE）和壞死性腸炎毒素B（NetB）增加了F和G型[11]，其中A型和C型Cp是導致畜禽發病的主要病原。

目前，在豬群各階段中廣泛流行的產氣莢膜梭菌病例中，一般認為C型菌株是導致2周齡內仔豬腸毒血癥和壞死性腸炎的主要病原，而A型菌株則與哺乳及肥育豬腸道疾病有關[12]。因此，豬產氣莢膜梭菌病主要是由A型或C型產氣莢膜梭菌引起各年齡階段豬發生的一種急性、致死性腸道傳染病。產氣莢膜梭菌除了引起仔豬發生高度致死性、壞死性腸炎外，近年來，由產氣莢膜梭菌引起肥育豬、后備種豬、懷孕母豬等猝死常有報道[2，13-14]。本研究對我國部分地區豬的產氣莢膜梭菌感染情況及菌株毒素分型進行調查和分析。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2021年3—10月試驗收集了湖南、浙江、福建、廣東等4省8市的規模化養豬場各階段豬的新鮮糞便樣品74份和腸道樣品15份，以及采集了廣州某生豬屠宰場肝臟和肺臟樣各30份，置于密封袋里，4 ℃保存。

1.2 樣品處理

糞便和腸道樣品：取適量小腸和結腸段內容物或適量糞便放置到含有20 mL PBS溶液的50 mL的離心管中，渦旋震蕩5 min，于室溫下靜置20 min。

肝臟和肺臟樣品：手術刀在酒精燈外焰上方灼燒后無菌烙燙肝臟和肺臟組織表面，在烙燙過的組織表面橫切一小口，用一次性接種環無菌蘸取組織樣，后把接種環置于含有20 mL PBS溶液的50 mL的離心管內，渦旋震蕩5 min，于室溫下靜置20 min。

1.3 產氣莢膜梭菌的分離鑒定

在超凈工作臺中，取50 mL離心管中樣品稀釋液上清100 μL加入到含有5 mL FT培養基的10 mL滅菌試管中，40 ℃恒溫培養箱中培養過夜。參考生活飲用水標準檢測方法中的微生物指標的稀釋方法，梯度稀釋培養過夜的菌液，濃度依次為10-1、10-2、10-3、10-4。分別取10-2、10-3、10-4各100 μL到3個含有環絲氨酸的TSC卵黃平板中，40 ℃恒溫培養箱厭氧培養12～16 h。挑取目的菌落接種進行增菌，提取DNA模板，經16S rDNA PCR后1%瓊脂糖凝膠電泳，后測序鑒定陽性菌株。

1.4 引物合成及反應條件

參考李昆等[15]文獻，使用由華大基因公司合成的細菌16S rDNA（27 F/1 492 r）通用引物（表1）。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52.0 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個循環；72 ℃延伸7 min。參考趙鳳菊等[16-17]文獻的引物進行毒素型分析，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～32個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物均用1%瓊脂凝膠電泳110 V，30 min檢測。

表1 7種毒素的特異性引物和細菌16S rDNA通用引物

2 結果與分析

TSC卵黃平板中周圍生長有乳白色渾濁的黑色菌落可能為產氣莢膜梭菌菌落（圖1左），對菌落進行革蘭氏染色鏡檢，為兩端稍鈍圓粗大桿狀革蘭氏陽性細菌（圖1右），再進一步進行分子鑒定。

圖1 產氣莢膜梭菌菌落及革蘭氏染色

2.1 PCR檢測結果

149份樣品經細菌分離培養純化后進行16S rDNA PCR鑒定，31份（20.81%）呈陽性，其中10份（13.51%）來源于糞便，5份（33.33%）來源于腸道，16份（26.67%）來源于肝肺組織樣品。

產氣莢膜梭菌16S rDNA PCR擴增片段大小約為1 500 bp，部分樣品檢測結果如圖2所示。陽性產物送檢華大基因測序確認為產氣莢膜梭菌。

圖2 產氣莢膜梭菌的PCR擴增電泳

2.2 產氣莢膜梭菌毒素型分析

對分離鑒定后得到的31株產氣莢膜梭菌進行毒素型鑒定（圖3），結果全部為A型產氣莢膜梭菌（100%），且攜帶Cpb2毒素23株（74.19%）；未見其他型菌株。

圖3 代表性分離株的PCR產物擴增電泳

2.3 豬產氣莢膜梭菌的檢測結果統計

廣州某生豬屠宰場肝臟和肺臟樣本各30份，檢出陽性分別為9份和7份，總陽性率為26.67%。不同地區、不同階段豬糞便和腸道樣品產氣莢膜梭菌的檢測結果見表2—表4。

表2 不同地區糞便產氣莢膜梭菌的檢測結果

表3 不同地區腸內容物產氣莢膜梭菌的檢測結果

表4 不同階段豬產氣莢膜梭菌檢測結果

結果顯示，各個地區受檢樣品中產氣莢膜梭菌陽性率不等，糞便陽性率檢測最高的地區為廣東肇慶和福建龍巖，腸道檢測率最高的地區為湖南永州和浙江金華，其次為福建龍巖。

3 討論

產氣莢膜梭菌可引起多種人獸共患傳染病，慢性表現為臨床癥狀不明顯，但急性易引起多種動物的突然猝死[18]，已成為危害人類及影響養殖業健康發展的重要病原之一。產氣莢膜梭菌所分泌的外毒素和各種酶是其主要致病因素，多作用于胃腸道，造成感染動物的急性死亡，其中A型產氣莢膜梭菌易引起人和動物的氣性壞疽和食物中毒。

產氣莢膜梭菌是動物腸道潛在的條件性致病菌群之一，當機體處于健康情況時該菌不會引起疾病，但當動物處于亞健康狀態或各種原因引起腸道炎癥時，胃腸道的菌群平衡被打破，菌群失調，產氣莢膜梭菌會快速增殖并產生大量毒素，對機體造成損傷[19]。

飼料全面禁抗后養殖業尤其是在生產管理、環境控制以及防疫保健跟不上或不到位的豬場，極易導致產氣莢膜梭菌等條件性致病菌的增多，壞死性腸炎等細菌性疾病發病率增加，甚至導致豬只死亡，并易繼發其他疾病造成養殖風險加大[20]。養殖戶除注意飼養管理外，更要采取相應的預防控制措施[21]。

本試驗對不同地區豬場不同階段的豬群糞便樣品、腸道內容物進行了檢測，結果顯示，不同地區豬場的不同階段豬群產氣莢膜梭菌檢測陽性率有所不同，可能跟環境及豬群健康管理水平及樣本數有關。毒素分型結果表明，普遍為A型且廣泛攜帶Cpb2毒素。根據王苗利等[22]提到的感染A型產氣莢膜梭菌小鼠體內α毒素的分布及定位研究，細菌在動物體內大量繁殖后產生毒素，因α毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶的活性，能破壞細胞膜結構的完整性，并隨血液循環系統到達宿主的特定臟器和全身，從而引起組織臟器的損傷。有研究證明，Cpb2毒素對某些細胞具有體外細胞毒性[23]。近年來很多文獻也表明Cpb2毒素與豬梭菌性腸炎有很大關系[24-26]。鑒于本試驗中屠宰場采集的肝肺樣品產氣莢膜梭菌的陽性檢出率比較高，可能因產氣莢膜梭菌增殖引致腸道菌群微生態平衡被打破，病原及毒素遷移到感染動物的肝、肺中，導致了全身性癥狀，既不利于動物的健康，同時也帶來食品安全問題，需引起關注。