一例豬德塔冠狀病毒的實驗室診斷及S基因部分序列與分析

崔志剛，于合宅

（1.望都縣農業農村局，河北 保定 072450；2.望都縣畜牧站，河北 保定 072450）

仔豬腹瀉在我國豬場十分常見，但導致仔豬腹瀉的病原較多，常見的腸道病毒是導致該病的重要病原，主要包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PoRV）等。豬德塔冠狀病毒屬于新發的豬腸道病毒，該病原感染仔豬可導致頑固性腹瀉、嘔吐和脫水等[1]。2012年中國香港地區首次報道PDCoV，其后該病原在全世界豬場廣泛流行。近年來，我國多地豬場腹瀉病例中也發現了PDCoV，且近年來其陽性率呈現逐步上升趨勢[2]。

大量研究表明，PDCoV感染仔豬引起的臨床和病理變化與PEDV和TGEV感染類似，但由于養殖人員對PDCoV不熟悉，容易造成誤診或漏診，繼而延誤疾病治療[1]。為此，筆者將2021年初河北某豬場因感染PDCoV導致腹瀉的診斷過程進行詳細闡述，旨在提高廣大養殖戶和獸醫從業人員對PDCoV的防控意識，同時為該病的診斷和防控積累材料。

1 豬場發病情況

2021年1月初，河北省某規模化豬場豬群開始發病，各階段豬群均有腹瀉癥狀，但以仔豬群發病最嚴重，其臨床癥狀主要包括消瘦（圖1A）、腹瀉（圖1B）、脫水和嘔吐等，發病仔豬持續性腹瀉3～4 d后死亡。據統計，該場發病仔豬約300頭，先后死亡106頭，其病死率高達35.33%。其它階段豬群（如母豬和肥育豬）也有發生腹瀉，但發病較輕，未造成死亡。

圖1 發病仔豬臨床癥狀及病理變化

2 臨床病理變化

對腹瀉嚴重且瀕臨死亡的仔豬進行剖檢，可見發病仔豬小腸內充滿氣體和黃色液體（圖1C），腸壁變薄、腸道和胃內容物中含有大量未消化的凝乳塊，且病豬的腹股溝淋巴結腫大、出血（圖1D）等。

3 實驗室診斷

為確診病因，筆者無菌操作采集3頭仔豬小腸組織、淋巴結、扁桃體等樣品送至河北省保定市動物疫病防治中心進行病原檢測。

3.1 細菌分離鑒定

用滅菌手術刀切開扁桃體、淋巴結深層組織，用酒精燈灼燒冷卻后的接種環蘸取少量組織液劃線接種于鮮血瓊脂培養基和普通瓊脂培養基，于恒溫箱（37 ℃）培養24 h，兩種培養基表面均未發現疑似菌落。

3.2 病毒與細菌核酸檢測

取部分病豬的腸組織、淋巴結和扁桃體，用手術刀切碎后混合，加入適量生理鹽水后研磨取上清液，用相應的DNA和RNA提取試劑盒對上清液中病原核酸分別進行提取，提取的基因組保存于-80 ℃。采用商業化試劑盒將提取的RNA樣品反轉錄為cDNA，獲得的cDNA基因組保存于-20 ℃，待檢。

對于細菌性病原檢測，筆者以DNA基因組為模板，通過PCR法擴增細菌性病原的16S rRNA基因序列，若有陽性PCR產物，則對其進行測序與分析。結果發現，所有核酸樣品中均沒有檢測到16S rRNA核酸，提示該場發病不是由細菌性病原感染引起。

其后，筆者以DNA或cDNA基因組為模板，通過PCR/RT-PCR法分別檢測豬偽狂犬病病毒（PRV-gE）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV）和豬德塔冠狀病毒（PDCoV）核酸，針對以上病原的特異性引物見參考文獻[3-4]，引物均由鄭州擎科智美生物科技有限公司合成。PCR反應結束后通過凝膠電泳進行初步鑒定。

結果如圖2所示，3份樣品中有2份樣品檢測為PDCoV核酸陽性，RT-PCR法擴增出約400 bp的陽性條帶（圖2），其它病原核酸均為陰性，其結果提示該場發生疫情可能是由PDCoV感染所致。

圖2 待檢樣品PDCoV特異性片段凝膠電泳鑒定

3.3 PDCoV毒株S基因部分序列擴增與分析

為進一步分析該毒株的遺傳進化特征，筆者以RT-PCR法對該毒株的S基因部分片段進行擴增、測序及分析，其引物序列信息為：PDCoVS-F：5'-AAACTTATAGCTGCGGCGGT-3'，PDCoV-S-R：5'-TGAAGGGTTTTGCCAGTGGT-3'。RT-PCR反應體系（50.0 μL）包括2×PCR預混液25.0 μL、上下游引物各2.0 μL、cDNA模板3.0 μL及滅菌蒸餾水18.0 μL；擴增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共35個循環；最后72 ℃ 5 min。擴增反應結束后取5.0 μL產物進行凝膠電泳，其后將陽性產物直接送至鄭州擎科智美生物科技有限公司進行雙向測序，并委托其對基因序列信息進行分析。

凝膠電泳結果顯示，目的條帶約為1 100 bp，且未擴增出非特異條帶，陽性與陰性對照均成立（圖3）。測序結果表明，該毒株S基因部分片段大小為1 105 bp，其核苷酸序列與GenBank收錄的參考毒株相應序列同源性為96.4%～99.7%，與國內流行毒株（如GX04-2018和GD01-2018等）同源性相對較高，僅出現個別核苷酸堿基突變或替換等，但與國外流行毒株[如Lowa136（美國）、KNU14-04（韓國）和HaNoi6（越南）]同源性較低，僅96.4%～98.2%。結果表明，獲得毒株與國內流行的PDCoV親緣性較近，可能該場暴發PDCoV病情是由于引種或生物安全防控措施不規范導致。

圖3 PDCoV毒株S基因部分片段RT-PCR擴增產物凝膠電泳鑒定

4 討論

仔豬腹瀉相關疾病嚴重威脅我國養豬業的健康發展，與腹瀉相關的病毒主要包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬德塔冠狀病毒（PDCoV）和豬輪狀病毒（PoRV）等。目前國內已有針對用于防控PEDV、TGEV和PoRV的二聯或三聯疫苗，但尚無PDCoV相關疫苗。以上病原感染后導致仔豬臨床癥狀相似，發病仔豬均會出現腹瀉、脫水等，且伴隨高發病率和死亡率，目前臨床上PEDV、PDCoV等腸道病原混合感染或與其它病原混合感染十分常見，這給臨床診斷及防控帶來了極大的困難[5]。

本研究通過臨床診斷、病理變化結合實驗室檢測結果，最終判定該場發病是由PDCoV感染所導致，且進一步序列分析結果表明該場流行的毒株與國內流行毒株親緣性較近，這也提示該場發生疫病可能是由于引種不規范或生物安全措施不到位導致。由于當前沒有PDCoV特定的防治藥物或疫苗，這也提示對于該病的防控需要依靠生物安全防控和提高豬群養殖水平等。

對于PDCoV的防治，可采取補液、止瀉和防脫水等策略進行對癥治療[1]：1）將發病豬群隔離后，發病較輕仔豬可口服慶大霉素、蒙脫石和葡萄糖溶液；發病嚴重豬群則口服電解質多維、慶大霉素和葡萄糖氯化鈉注射液；對于無治療意義的豬群進行處死后無害化處理；2）提高生物安全管理水平，主要包括加強消毒頻率，實行帶豬消毒；在豬場通道鋪撒生石灰等；3）適當提高豬舍內溫度，將室內溫度穩定在28 ℃左右，產床保溫箱內溫度穩定在30～32 ℃；對豬群提供優質全價飼料等。