一例豬沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

于新友，李天芝

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.濱州渤海先進技術研究院，山東 濱州 256600）

沙門氏菌有2 500多個血清型，在環境中廣泛存在，可感染多種動物和人，是一種人獸共患病原菌。豬沙門氏菌病又稱仔豬副傷寒[1]，是由豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等引起[2]。該病是一種急性、亞急性、慢性細菌性傳染病，臨床表現主要為敗血、腸炎、肺炎、腦炎等[3]。各日齡豬均可感染，2～4月齡豬發病率、死亡率高[4]。一年四季均可發病，多雨潮濕季節多發[5]。易與多種疾病混感，豬群死亡率增加。病豬和帶菌豬是主要傳染源，主要通過消化道傳播。病豬耐過后成為僵豬，生長發育緩慢[6]。該病在全球范圍廣泛流行，給養豬業造成嚴重的經濟損失，隨著禁抗時代的到來，該病在豬場發病率有增加趨勢。

2021年4月濱城區周邊某養豬場，共飼養32頭保育豬，部分豬只精神沉郁，體溫升高達42 ℃，食欲廢絕，呼吸急促，眼有膿性分泌物，糞便灰黃色，惡臭，糞中帶血，腹下部有紫色斑點，自行抗生素治療，無明顯效果，3 d后1頭豬衰竭死亡，剖檢可見脾臟腫大，質地硬如橡皮，切面呈藍紫色；腎臟腫大、出血；肝臟有白色壞死點；腸系膜淋巴結腫大，腸黏膜壞死、脫落。無菌采集病死豬肝臟、脾臟等臟器作樣品，進行細菌分離、形態學觀察、PCR鑒定、生化試驗、藥敏試驗及致病性試驗，現報告如下。

1 材料

1.1 試驗時間與地點

2021年4月11日至5月15日，在山東綠都生物科技有限公司質量監察部進行試驗。

1.2 病料

對濱城區周邊某養殖戶疑似沙門氏菌病死豬解剖，無菌采取肝臟、脾臟等臟器。

1.3 試驗用動物

18～22 g昆明小白鼠8只，購自山東省實驗動物中心。

1.4 試劑

普通瓊脂平板、血瓊脂平皿、SS瓊脂平皿、馬丁液體培養基、LB液體培養基、革蘭氏染色液如草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復紅染液等均由山東綠都生物科技有限公司質量監察部提供；糖發酵管及生化反應試劑和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司； Pro Taq HS預混型探針法熒光PCR檢測試劑購自艾科瑞生物， DL 2 000 DNA Marker、pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠純化回收試劑盒等購自百泰克生物科技有限公司。

1.5 PCR引物設計

參照文獻[7]根據沙門氏菌invA 基因序列引物和探針，引物序列為F：5'-CTGACCATT GGTGATGGTCTT-3'，R：5'-TCGCCCAGATCCC CGCA-3'，探針序列為P：5'-GGCACTAATCGCAA TCAACA-3'，建立了檢測沙門氏菌的通用型熒光PCR檢方法，熒光基團標記為FAM，淬滅基團標記為BHQ1。引物和探針由通用生物系統（安徽）有限公司合成。

2 方法

2.1 直接涂片鏡檢

將無菌采取的病死豬肝臟、脾臟，玻片觸片，后酒精燈火焰干燥、固定后，傳統革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢觀察結果。

2.2 細菌分離培養

將采集的豬肝臟、脾臟等無菌條件下劃線接種于準備好的血瓊脂培養皿，37 ℃培養24 h，觀察生長情況，挑取平皿上單菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢[5]。挑疑似菌落再次劃線接種于SS瓊脂培養皿，純化培養，收獲，按1∶20比例接種于馬丁肉湯液體培養基，37 ℃培養24 h。

2.3 玻片凝集試驗

取清潔玻片，移液器吸取20 μL沙門氏菌多價O血清至玻片上，吸取2.2制備的沙門氏菌純培養物20 μL，槍頭涂布混勻后，2 min觀察反應結果。

2.4 生化鑒定

取2.2收集的純化培養后的分離菌液，按試劑說明書進行糖發酵試驗及其他生化試驗。

2.5 PCR檢測

取2.2收集的純化培養后的分離菌液，提取細菌基因組DNA作模板，進行熒光PCR擴增反應。反應體系（20 μL）：2×Pro Taq HS Probe Primix 10 μL，上游引物1 μL（10 pmol/L），下游引物1 μL（10 pmol/L），探針0.5 μL（10 pmol/L）。模板1 μL，加水補足至20 μL。擴增反應程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，45個循環。

2.6 藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法，取2.2純培養分離菌液，進行適當濃度稀釋后，無菌棉簽均勻涂布在血瓊脂培養基上，用鑷子夾取藥敏紙片放置在平板上，保持紙片間適度距離，每個平板上最好不超過6張藥敏紙片。將平板置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，觀察結果，測量并記錄抑菌圈直徑。

2.7 致病性試驗

將8只昆明小鼠平均分為兩組，試驗組和對照組數量相同。按2.2操作制備分離細菌純培養液，腹腔接種小鼠0.2 mL/只 （菌體含量5×108CFU/mL），對照組小鼠腹腔注射0.2 mL馬丁液體培養基作對照。試驗組和對照組小鼠分開飼養，連續觀察7 d，記錄小鼠狀態，對死亡及試驗結束存活小鼠剖殺，無菌采集肝臟、脾臟等，重新進行細菌分離。

3 結果與分析

3.1 直接涂片鏡檢

肝臟、脾臟觸片后，革蘭氏染色后鏡檢，可見紅色短桿狀兩端鈍圓菌體，呈單個或散在，符合沙門氏菌特性。

3.2 細菌分離培養

在血瓊脂平皿上37 ℃培養24 h后，可見灰白色、圓形、隆起、邊緣整齊圓潤的菌落。在SS瓊脂平皿上37 ℃培養24 h后，可見黑色、邊緣整齊、濕潤光滑菌落。挑單個菌落涂布于加生理鹽水的玻片上，革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢觀察，可見革蘭氏染色呈陰性、單個存在、散在排列、兩端鈍圓的短小桿菌。馬丁肉湯培養基培養時，菌液呈均勻渾濁，管底有灰白色沉淀物。

3.3 玻片凝集試驗

槍頭涂布混勻后，2 min內出現典型凝集現象，進一步表明所分離菌為豬沙門氏菌。

3.4 生化試驗

由表1可知，所分離沙門氏菌不能發酵水楊苷、肌醇、菊糖、蔗糖、乳糖，能發酵葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、衛矛醇，H2S試驗陽性，MR試驗陽性，V-P試驗陰性，靛基質試驗陰性，與沙門氏菌的生化特征一致。

表1 分離菌的生化反應結果

3.5 PCR檢測

采用沙門氏菌通用引物和探針對所分離菌進行熒光PCR檢測，結果顯示，所分離未知菌有S型擴增曲線（圖1），陰性和陽性對照均成立，說明分離菌為沙門氏菌。

圖1 分離菌熒光PCR擴增結果

3.6 藥物敏感性試驗

由表2可知，分離菌對頭孢噻呋、丁胺卡那、磷霉素高度敏感，對強力霉素、恩諾沙星、環丙沙星中度敏感，對四環素、林可霉素、大觀霉素、氟苯尼考、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、阿莫西林耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結果 mm

3.7 致病性試驗

試驗組小鼠注射分離菌液10 h后，精神沉郁，采食和活動減少，20 h后被毛粗亂，對外界刺激反應遲鈍，拉血便，30 h后1只開始死亡，72 h內試驗組小鼠全部死亡。剖檢可見小鼠肝臟有壞死點、脾臟腫大，腸道出血。無菌取肝臟，細菌分離后，革蘭氏染色鏡檢，可見呈革蘭氏染色陰性短小桿菌。對照組小白鼠全部健活，處死后剖檢沒有分離到細菌。

4 討論

沙門氏菌是豬場環境中常在菌，對外界環境抵抗力強，廣泛存在于環境和豬體中。當天氣驟變、飼養管理不當、衛生條件不良、長途運輸或豬群遭受其他應激時容易誘發。豬沙門氏菌病是豬的一種常見多發的細菌性傳染病。對豬沙門氏菌病主要應以預防為主，飼喂優質全價配合飼料，不突然更換飼料。加強飼養管理，飲水中添加消毒劑。環境溫度和濕度適宜，盡量減少豬群密度和不必要的應激。做好豬副傷寒活疫苗免疫接種工作，具體為懷孕母豬在產前20～25 d經口免疫，仔豬15～20日齡首免，間隔3～4周再免疫1次。做好豬瘟、偽狂犬病等其他常規疫苗的免疫接種工作。發病后可分離病原菌，進行藥敏試驗，選用敏感抗生素治療，同時注意聯合用藥，以提高豬群治療效果。

本試驗對濱城區周邊某養殖戶送檢豬病料進行細菌分離、生化試驗、PCR檢測、藥敏試驗和小鼠致病性試驗。生化試驗結果表明，該分離菌生化特征與沙門氏菌一致，不能發酵水楊苷、肌醇、菊糖、蔗糖、乳糖，能發酵葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、衛矛醇，H2S試驗陽性，MR試驗陽性，V-P試驗陰性，靛基質試驗陰性，與沙門氏菌的生化特征一致。沙門氏菌容易產生耐藥性，加上臨床抗生素不合理使用，一些理論上有效的藥物應用后常不能達到預期效果，所以要進行細菌分離后篩選有效藥物。藥敏試驗結果表明，該分離菌對頭孢噻呋、丁胺卡那、磷霉素高度敏感，對強力霉素、恩諾沙星、環丙沙星中度敏感，對四環素、林可霉素、大觀霉素、氟苯尼考、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、阿莫西林耐藥。豬場按照藥敏試驗結果，將病情嚴重豬只挑出，隔離飼養，頭孢噻呋注射，全群強力霉素拌料飼喂，同時在飲水中添加2倍劑量的高質量黃芪多糖和電解質多維，或者在飼料中加入粉碎的復方中草藥制劑（包括白頭翁10 g、黃連10 g、蒼術6 g、車前子10 g）連續飼喂7 d[8]，同時加強環境消毒，沙門氏菌對多種消毒劑敏感，可選用聚維酮碘、戊二醛、石碳酸、氫氧化鈉、來蘇爾等[9]，圈舍每天清理糞便污物，保持干燥、清潔和衛生，減少豬群飼養密度，加強通風，死亡豬只無害化焚燒或深埋處理，5 d后豬場情況好轉，無死亡豬只。初步分析該豬場發病原因為該豬場為新建豬場、并未免疫仔豬副傷寒活疫苗，飼養管理經驗不足，加上天氣突然變化所致，及時采取措施后為豬場挽回了損失。本試驗分離的沙門氏菌對小鼠有較強的致病性，下一步計劃對該菌進一步分型鑒定，豐富豬場自家滅活疫苗的菌種庫研制，以更好地防控豬病。