營養(yǎng)條件和傳代次數(shù)對(duì)恢復(fù)大腸桿菌藥物敏感性的影響

代振江，李 達(dá)，呂世明，馮文武，李 俊，王維維，梁 蕭，任曉慧，張 瑞，何 慶

（1.貴州省綠色食品發(fā)展中心，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市黔靈山公園動(dòng)物園，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州 貴陽 550025；5.黔西南布依族苗族自治州冊(cè)亨縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 黔西南布依族苗族自治州 552200）

當(dāng)前，我國各大養(yǎng)殖場(chǎng)細(xì)菌耐藥情況非常嚴(yán)重，多重耐藥甚至泛耐藥菌株不斷出現(xiàn)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大威脅，造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。2016—2018年，黃麗等在安徽省收集了12 216株非重復(fù)菌株，發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌分別為74.7%、84.5%、85.3%，表明細(xì)菌耐藥狀況日益嚴(yán)重，多重耐藥菌檢出率在持續(xù)上升[2]。2018年連俊偉對(duì)分離自豬場(chǎng)的200株大腸桿菌開展藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明分離的大腸桿菌對(duì)氯霉素、氟苯尼考的耐藥率高達(dá)90%以上，且存在多重耐藥的情況[3]。為探索影響大腸桿菌耐藥性的因素，文章對(duì)營養(yǎng)條件和傳代次數(shù)進(jìn)行了研究，探索其與大腸桿菌耐藥性的關(guān)系。

1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)于2020年6月至2021年4月在貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。試驗(yàn)所用原始菌株為分離自養(yǎng)豬場(chǎng)的對(duì)環(huán)丙沙星高度耐藥的大腸桿菌。環(huán)丙沙星、米勒-海頓肉湯和LB肉湯、96孔聚苯乙烯板購自上海盛思生化科技有限公司。

2 方法

2.1 接種物的制備

將試驗(yàn)分為6個(gè)組，分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6，其中第1組的離心管中為正常濃度的LB培養(yǎng)基，2～6組的離心管中分別為稀釋2、4、8、16、32倍的LB培養(yǎng)基。將高度耐藥的大腸桿菌菌液加入1～6組的離心管中，連續(xù)傳代培養(yǎng)至210代，將30、60、90、120、150、180、210代的對(duì)數(shù)生長期菌液用MH肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，用MH肉湯按1∶100稀釋菌液備用。

2.2 MIC板制備

按照100 μL/孔的標(biāo)準(zhǔn)，將MH肉湯加到聚苯乙烯板；將環(huán)丙沙星稀釋到512 μg/mL，并吸入聚苯乙烯板第1列，100 μL/孔，讓第1列每孔中均有肉湯和環(huán)丙沙星混合液200 μL，藥物濃度保持在256 μg/mL，倍比稀釋到第11列，棄掉100 μL，將第12列作為對(duì)照組不添加任何藥液。最終，聚苯乙烯板中第1～11列每孔含環(huán)丙沙星100 μL，濃度分別是256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL。共制7塊板，編號(hào)1～7，制備好后，冰凍干燥密封，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 接種培養(yǎng)

向MIC板1到11列依次加入培養(yǎng)的大腸桿菌100 μL，第12列作為陰性不加菌液，該試驗(yàn)有6組，MIC板的1～6排對(duì)應(yīng)加入1～6組的菌液，此時(shí)每孔菌液濃度約為5×105CFU/mL，第1～11列的環(huán)丙沙星濃度分別為128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL，1～7塊MIC板分別接種30、60、90、120、150、180、210代的對(duì)數(shù)生長期大腸桿菌菌液，將接種好的MIC板蓋好，置于35 ℃培養(yǎng)箱16～20 h。

2.4 試驗(yàn)菌株對(duì)抗菌藥物敏感性的測(cè)定

本試驗(yàn)通過微量肉湯稀釋法判定環(huán)丙沙星對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC），以美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)判定敏感性。

2.5 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS軟件處理得出的試驗(yàn)結(jié)果。

2.6 結(jié)果判斷

記錄每組完全抑制大腸桿菌的最低抑菌濃度。只有陽性對(duì)照孔大腸桿菌顯著生長、陰性對(duì)照孔無細(xì)菌生長時(shí)，才能采用試驗(yàn)結(jié)果。如果有單一跳孔的情況，應(yīng)記載抑制細(xì)菌生長的最高藥物濃度。如若多處出現(xiàn)跳孔，則需進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

2.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

根據(jù)CLSI 2009版推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)得的大腸桿菌分離株對(duì)常用2種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），按CLSI 2009版推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大腸桿菌藥物敏感性判定。

3 結(jié)果

通過分析表1數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，2倍和4倍稀釋的培養(yǎng)基對(duì)傳代培養(yǎng)的大腸桿菌恢復(fù)環(huán)丙沙星敏感性的影響較小，在稀釋8倍、16倍、32倍的培養(yǎng)基中，大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性恢復(fù)較快，傳代至150、180代其MIC值降低到接近敏感值，到210代即全部恢復(fù)為敏感，表明細(xì)菌傳代培養(yǎng)的營養(yǎng)條件對(duì)恢復(fù)大腸桿菌藥物敏感性有一定影響性，但培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)與MIC值之間并不存在線性降低的關(guān)系，其中培養(yǎng)基稀釋16倍時(shí)MIC值的估計(jì)邊際均值最低（圖1）。

表1 傳代次數(shù)和不同濃度培養(yǎng)基對(duì)藥物敏感性恢復(fù)的影響

對(duì)培養(yǎng)基稀釋8倍、16倍、32倍3組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出大腸桿菌傳代次數(shù)與環(huán)丙沙星MIC之間存在逆曲線模型關(guān)系（圖2），不存在線性關(guān)系。在培養(yǎng)基稀釋8倍、16倍、32倍的條件下，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)菌耐環(huán)丙沙星MIC值呈逆曲線降低，直至180代、210代降低到敏感范圍MIC值0.25 μg/mL。綜上所述，耐藥大腸桿菌在較低的營養(yǎng)條件下可能恢復(fù)對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性。

圖2 培養(yǎng)基稀釋8、16、32倍傳代次數(shù)與MIC值曲線

4 討論

抗生素在動(dòng)物臨床上濫用，使各大養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物細(xì)菌耐藥性不斷攀升，為探索恢復(fù)細(xì)菌耐藥性的方法，本試驗(yàn)用分離自貴州養(yǎng)豬場(chǎng)的對(duì)環(huán)丙沙星高度耐藥大腸桿菌作為試驗(yàn)對(duì)象，分別探究了營養(yǎng)條件和傳代次數(shù)對(duì)環(huán)丙沙星高度耐藥大腸桿菌恢復(fù)敏感性的影響，結(jié)果顯示，對(duì)耐藥菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)能一定程度降低大腸桿菌耐藥性，但影響不大；將耐藥大腸桿菌在稀釋8、16、32倍的營養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至210代時(shí)，恢復(fù)了對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性，表明較低的營養(yǎng)條件能促使大腸桿菌恢復(fù)對(duì)藥物的敏感性。

2019年，秦會(huì)玲等發(fā)現(xiàn)在母豬舍、妊娠舍、肥育舍、仔豬舍和產(chǎn)房等5個(gè)采樣點(diǎn)的廢水中細(xì)菌耐藥率較高，在經(jīng)過處理后的污水池和沉淀廢水中細(xì)菌耐藥率顯著下降[4]。推測(cè)這可能是由于處理后的污水池和沉淀廢水中營養(yǎng)條件相對(duì)較低，細(xì)菌在這樣的環(huán)境條件下耐藥性不斷下降，與本試驗(yàn)結(jié)論一致。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果提示，建議豬場(chǎng)在飼養(yǎng)管理過程中要加強(qiáng)衛(wèi)生清潔，定期清掃圈舍，加強(qiáng)糞污處理，做好污水排放，破壞細(xì)菌的適宜生存環(huán)境，促進(jìn)已經(jīng)形成的耐藥菌逐步恢復(fù)藥物敏感性。