寧鄉豬精液冷凍技術效果的研究

劉海林，羅子燕，朱立軍，姜 虹，戴文靜，燕海峰

（1.湖南光大牧業科技有限公司，湖南 長沙 410131；2.寧鄉市動物疫病預防控制中心，湖南 長沙 410600；3.湖南省畜牧獸醫研究所，湖南 長沙 410131）

寧鄉豬，原名流沙河豬或草沖豬，具有早熟易肥、肉質細嫩、肉味鮮美、耐粗飼、繁殖力高等特點，是國家級“雙保”豬種。目前寧鄉豬采取原生態保種方式（根據自然村劃分的10個血緣系別進行車輪式交配）[1-2]。

豬凍精技術是指從公豬體內采集到的原精經過稀釋、平衡、降溫和冷凍等工藝處理之后，保存在-196 ℃的液氮中，抑制精子的生理代謝活動，從而達到長期儲存的目的。使用時，將豬凍精放在特定的溫度下，使其解凍復蘇后恢復正常受精能力。相對于活體保種，通過精液冷凍技術保種具有以下優點：1）減輕保種工作量，降低保種成本；2）易于控制重大烈性疾病的傳播；3）凍精保存年限可達200年，解決由于疾病、天災人禍、近親交配等帶來的血緣滅絕問題；4）種群擴繁和恢復速度快[3]。

本試驗通過分析寧鄉豬冷凍前和冷凍后精液活力，對寧鄉豬精液保種的應用、優化操作流程等進行探索，從而為避免因重大疫病對地方豬種的毀滅性打擊、降低保種成本等提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2020年4—5月在湖南省畜牧獸醫研究所進行。

1.2 主要儀器與試劑

視頻溫控顯微鏡（HW-39A，江西新怡光學儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-SI，金壇市醫療儀器廠）；電子冷暖箱（FYL-12MC-B3，北京福意聯醫療設備有限公司）；程序冷凍儀（米尼圖）；細管（0.25 mL，法國IMV卡蘇科技股份有限公司）；精液稀釋粉（AndroPro?Plus米尼圖）；冷凍稀釋粉（Androhep?CryoGuard，米尼圖）；Equex-Paste（米尼圖）；卵黃（采用新鮮雞蛋自制）；解凍劑（Androhep CryoGuard Thaw，米尼圖）。

1.3 試驗方法

分別從上扶、下扶、花橋、山林、蓮花、石柱、蘇家7個地方取2歲左右成年寧鄉種公豬各5頭，每頭重復采精3次，每次采集間隔5 d。

每次凍精制作完畢后，選取下扶、花橋、山林和石柱4個地方的豬凍精各1支（每次做3～5個重復樣）進行常規解凍，然后與預熱好的解凍液混勻，共同置于36 ℃水浴鍋中，放置0.5、1、2、3 h后檢測精子活力。

1.3.1 采精與預處理 采用手握法收集富含精子的精液（射精中間部分），采用4～6層過濾紙除去精液中的膠質部分；用預先配制好的等溫稀釋液（溫差1 ℃內）按1∶1的比例倒入精液中，攪拌均勻，室溫靜置1 h后，放入17 ℃車載冰箱中，送回實驗室。用米尼圖精子分析系統測定稀釋后精液的活力和密度，選擇稀釋活力超過0.4的精液進行下一步試驗。

1.3.2 營養稀釋劑的制備 卵黃液：采購市售新鮮褐殼雞蛋，用70%酒精擦拭表面；晾干后打開蛋殼，倒出蛋白；把蛋黃在干凈無絨的紙巾上呈口字型滾動，黏走剩余的蛋白；用無菌注射器把蛋黃吸到燒杯中備用。

稀釋液：將45 g精液稀釋粉溶解于1 L的蒸餾水中（預溫32～37 ℃）。

冷凍保護液Ⅰ：將44 g冷凍稀釋粉溶解于400 mL蒸餾水中（預溫32～37 ℃），再加入100 mL雞蛋黃，拌勻；冷卻至15 ℃后待用。

冷凍保護液Ⅱ：將40.7 g冷凍稀釋粉完全溶解于370 mL蒸餾水中（預溫32～37 ℃），再加入100 mL雞蛋黃，拌勻；再加入37.7 g（=30 mL）純凈甘油，拌勻；然后加入5 mL Equex paste，拌勻；冷卻至5 ℃后待用。

解凍液：將50 g解凍劑溶解于1 L蒸餾水中（預溫32～37 ℃）。

1.3.3 離心、稀釋、平衡與裝管 將稀釋后的精液轉移到50～80 mL的離心瓶里，在15 ℃和2 750 r/min的條件下離心12 min，棄上清液。

根據預設凍精密度，將計算好體積的冷凍保護液Ⅰ分批次緩慢加入到沉淀精子中，以吸吐方式混合均勻；再用剩余的冷凍保護劑Ⅰ洗滌離心管，合并到稀釋后的精液中。

將稀釋后的精液先放入一個盛有無菌蒸餾水（15 ℃）的200 mL燒杯中，再一同放入4 ℃的冰箱平衡1.5～2 h。

將冷凍保護液Ⅱ緩慢地加到4 ℃的精液中，輕輕晃動來混合均勻。

在5 ℃條件下，15 min內完成每頭份精液的裝管（0.25 mL），封口；再轉移到5 ℃的冷凍冰柜中，平衡3 h，然后換高壓滅菌的針頭和導管，進行下一頭份裝管。

1.3.4 冷凍和解凍 將平衡后的細管迅速轉移到應用程序冷凍儀中，降溫冷凍程序為：5 ℃降至-10 ℃時間為3 min，-10 ℃降至-100 ℃的時間為2.5 min，-100 ℃降至-140 ℃時間為2 min，然后在-140 ℃下裝入袋中，做好標記，最后快速投入液氮中。

從液氮罐中取1支細管，迅速放入38 ℃水浴鍋中快速晃動30 s，剪去空氣端，注入1 mL預熱的解凍液中，搖勻放入水浴鍋（38 ℃）靜置1 min后用精子分析系統檢測精液凍后質量。

1.3.5 精子活力與密度檢測 通過米尼圖精子分析系統選取樣品中3處不同視角來測量精液稀釋、平衡、解凍的活力和精子密度。

1.4 統計分析

數據用SPSS軟件對各性狀進行稀釋、平衡、解凍的活力和密度的差異顯著性檢驗和單因素方差分析比較，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同血緣系別寧鄉豬精液質量參數

從表1可見，不同血緣系別寧鄉豬精液射精量有顯著差異（P＜0.05），其中花橋的寧鄉豬顯著高于其他地方寧鄉豬（P＜0.05）；但是從后續研發試驗中發現，花橋的原精量不穩定，這可能與人為因素（取射精中間部分的多少視現場情況而定）和公豬的飼養管理有關。

表1 不同血緣系別寧鄉豬精液質量參數

不同血緣系別寧鄉豬的稀釋活力和稀釋密度差異不顯著（P＞0.05）。

本試驗只測定了稀釋活力，這是由于采精點比較分散，沒有正規的檢測設備，無法準確測定原精活力。

2.2 不同血緣系別寧鄉豬精液經過稀釋、平衡、解凍后的活力及其損失情況

從表2可見，不同血緣系別寧鄉豬精液稀釋活力和平衡活力均差異不顯著（P＞0.05）；其中下扶、花橋、山林和蘇家的寧鄉豬平衡活力均高于稀釋活力，這可能與精液經過離心等工藝去除部分死精和畸形精子有關。

表2 不同血緣系別寧鄉豬精液經過稀釋、平衡、解凍后的活力及其損失情況

不同血緣系別寧鄉豬凍精解凍活力沒有顯著差異（P＞0.05）。其中山林和蓮花寧鄉豬解凍活力均優于其他地方的寧鄉豬，并達到凍精配種使用標準（40%以上）。

大部分寧鄉豬的平衡活力要略高于稀釋活力，而解凍活力較稀釋活力平均降低了19個百分點，這說明精子損失活力主要出現在精液平衡后到解凍之間，這可能與裝管和冷凍過程中精子溫度和滲透壓等參數的變化有關，需要后續試驗進一步優化流程，降低精子損失活力，從而提高凍精制作的成功率。

2.3 不同血緣系別寧鄉豬精液解凍后活力維持情況

由表3可見，不同血緣系別寧鄉豬精液解凍后活力在3 h內無顯著下降趨勢（P＞0.05）。在3 h內，花橋、山林和石柱寧鄉豬的解凍活力在40%以上，達到了配種標準。

表3 不同血緣系別寧鄉豬精液解凍后不同時間段的活力

3 討論

3.1 本試驗初步確定了寧鄉豬的凍精制作方案，從原精選擇、生產工藝和設備、營養稀釋劑的制備、解凍活力及其維持情況等作系統性探索，結果表明，山林和蓮花寧鄉豬解凍活力均達到配種要求（40%以上），說明本試驗凍精制作流程和方案是可行的。

3.2 李祥等（2016）報道大河烏豬的采精量233.23 mL；精子活力71.26%[4]；本試驗測定寧鄉豬平均采精量260.42 mL、稀釋活力58.6%；后續試驗中測定湖南其他地方豬種沙子嶺、大圍子和湘西鐵骨豬的精子活力分別為64.8%、62.5%和72.2%（未發表）；由此可見，當地品種的公豬精子活力普遍較低，很難達到張樹山等（2020）報道的豬凍精制作要求原精活力在70%以上[5]。本試驗發現，寧鄉豬凍精制作整個流程中，精子活力平均損失19個百分點，以40%的解凍活力標準，那么原精的稀釋活力至少在57%以上；因而本試驗初步確定稀釋活力達到60%才可以進行下一步凍精制作。

3.3 本試驗發現，寧鄉豬精子活力在解凍后，可在3 h內達到配種標準，但具體能延長多長時間與具體實踐使用環境和操作等有關。