實時熒光定量PCR 在新生兒肺炎鏈球菌性腦膜炎中的應用

盧改龍 陳文娜 王倩茹 王舒萍 黃君華

（西安醫學院醫學技術學院，陜西 西安 710021）

0 引言

細菌性腦膜炎（Bacterial Meningitis，BM）是一種嚴重危害新生兒生命的中樞神經系統感染性疾病，病死率高且常有不同程度的神經系統后遺癥[1，2]，其中尤以肺炎鏈球菌性BM 后遺癥發生率最高，預后較差[3]。因此快速鑒定BM 病原菌對降低該病后遺癥發生率和病死率至關重要[4]。 目前，BM 的病原學診斷主要依靠培養，但培養敏感性低，時間長，延誤最佳診療時機。 本研究以患肺炎鏈球菌性腦膜炎新生兒為研究對象， 旨在應用熒光定量PCR （FQ-PCR） 擴增腦脊液（Cerebrospinal Fluid，CSF）標本中病原菌 DNA，探求腦脊液細菌載量與臨床表現及相關實驗室檢測指標之間的關系， 探討FQ-PCR 在檢測BM 病原菌中的作用，為判斷患兒預后和轉歸提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

采集2020 年1 月至6 月就診于西安市兒童醫院的15 例經16S rDNA 測序鑒定為肺炎鏈球菌BM 新生兒為研究對象，男 6 例，女 9 例，年齡 2～20 天。 其中10 例培養陽性，5 例培養陰性。

1.2 方法

1.2.1 CSF 培養

嚴格無菌操作采集每位患兒CSF 標本2～4 ml，其中1ml 注入BD 公司EDTA-K2 抗凝管， 剩余進行培養，培養陽性細菌經VITEK 全自動細菌生化藥敏鑒定儀鑒定到種。 質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.2.2 DNA 提取

將 1mlCSF 標本 12 000 rpm 離心 5 min， 取最下層沉淀，應用QIAamp Blood DNA Mini Kit 試劑盒，提取步驟見參考文獻[5]。

1.2.3 16S rDNA 擴增及測序比對

PCR 反應體系及條件見參考文獻[6]。 擴增產物送上海生工生物工程有限公司測序， 測序結果在GenBank 中 BLAST 比對。

1.2.4 FQ-PCR

應用伯樂CFX96TMReal-time 定量 PCR 系統，特異性引物參照文獻[7]，5’-ACGCAATCTAGCAGATGAA GCA-3’，5’-TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT-3’， 擴增肺炎鏈球菌 lytA 基因。 20 μl 反應體系，10 μl SYBR Green Realtime PCR Mix，引物（10 μM）各 0.8 μl，模板2μl，ddH2O6.4 μl。 反應程序：95°C 預變性 5 min，進入循環 95°C 變性 10 sec，60°C 退火 15 sec，72°C 延伸35 sec （采集熒光）。 40 個循環后分析溶解曲線：Melt curve 65°C→95°C，Increment 0.5°C，5 sec。 最后得到標準曲線（Standard Curve）、溶解曲線（Melt Curve）的 Ct值等數據。

1.2.5 統計學方法

應用SPSS 17.0 統計軟件。 計量資料采用兩獨立樣本t 檢驗，組間計數資料進行卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺炎鏈球菌定量結果

熔解曲線分析為單一峰圖， 無非特異性擴增，如圖1 所示。

圖1 肺炎鏈球菌熒光定量PCR 結果

2.2 15 例臨床樣本培養、FQ-PCR 及相關指標結果

15 例CSF 樣本的相關實驗室檢查結果如表1 所示， 其中 10 例培養陽性標本細菌載量 Ct 均值為19.52（19.52±4.32），5 例培養陰性標本細菌載量 Ct 均值為 31.32 （31.32±1.74）， 二者差異具有統計學意義（t=-5.793，P<0.05），說明培養陽性率與 CSF 中細菌含量有關。 筆者將10 例培養陽性設定為“低Ct 值組”，5例培養陰性設定為“高Ct 值組”，通過分析發現：“低Ct 值組”發熱的例數較“高Ct 值組”多；腦脊液白細胞計數“低 Ct 值組”72.19（72.19±26.27）與“高 Ct 值組”37.64 （37.64±13.71） 二者差異具有統計學意義 （t=2.725，P<0.05）； 腦脊液蛋白含量 “低 Ct 值組”1.80（1.80±0.77）與“高 Ct 值組”0.86（0.86±0.30）二者差異具有統計學意義（t=2.607，P<0.05）；腦脊液葡萄糖含量“低 Ct 值組”1.55（1.55±0.46）與“高 Ct 值組”2.46（2.46±0.80） 二者差異具有統計學意義 （t=-2.825，P<0.05）；外周血白細胞計數“低 Ct 值組”10.52（10.52±3.11）與“高 Ct 值組”6.88（6.88±2.52）二者差異具有統計學意義（t=2.313，P<0.05）；而嘔吐、黃疸、驚厥、囟門膨脹、腦膜刺激征、肌張力改變等的表現在兩組之間無統計學差異。 另外，C-反應蛋白（CRP）含量“低Ct值組”4.72（4.72±2.41）與“高 Ct 值組”2.50（2.50±0.97）二者差異無統計學意義（t=1.950，P>0.05）。 （見表 2）

表1 15 例腦脊液標本相關檢測結果

表2 低Ct 值組與高Ct 值組臨床表現和檢測結果的比較

3 討論

BM 為病原菌侵入中樞神經系統， 嚴重危害新生兒生命健康，病死率高[8]，常會引發不同程度的神經系統后遺癥[9，10]，而尤以肺炎鏈球菌性BM 后遺癥發生率最高，患兒預后最差。 目前，BM 的病原學診斷主要依靠CSF 培養，但培養法敏感性低、耗時久且無法準確定量，延誤最佳診治時機，而FQ-PCR 可為快速檢測CSF 中病原菌提供新方法。 本研究利用FQ-PCR 可以定量檢測的優勢將定量結果與相關臨床表現及實驗室檢查進行比較， 以求探討肺炎鏈球菌載量對患兒的影響，為疾病預后和轉歸提供依據。

本研究納入的15 例樣本均經16S rDNA 測序比對為肺炎鏈球菌性BM，其中10 份培養陽性，5 份培養陰性； FQ-PCR 均得到擴增曲線。 定量結果顯示10份培養陽性標本細菌載量Ct 值在13.1~27.1 （均值為19.52），5 例培養陰性標本 Ct 值在 29.3-33.8 （均值為31.32），二者差異具有統計學意義，說明培養陽性率與腦脊液細菌含量有關，一般需達到103CFU/ml 以上。

兒童肺炎鏈球菌性BM 臨床表現主要為發熱，外周血白細胞計數、CRP、腦脊液白細胞計數及蛋白水平均會增高，腦脊液葡萄糖含量會下降[11]，但上述表現與腦脊液肺炎鏈球菌含量的關系目前報道較少。 本研究通過將10 例培養陽性設定為 “低Ct 值組”，5 例培養陰性設定為“高Ct 值組”，可發現：臨床表現方面，發熱的例數在“低 Ct 值組”較“高 Ct 值組”多，而嘔吐、黃疸、驚厥、囟門膨脹、腦膜刺激征、肌張力改變等的表現在兩組之間無統計學差異，說明新生兒由于囟門和顱骨未閉，其腦膜刺激征等表現不明顯，但發熱可能與CSF 病原菌含量有關。 實驗室檢查方面，“低Ct 值組” 與“高 Ct 值組”在腦脊液白細胞計數（t=2.725，P<0.05）、腦脊液蛋白含量（t=2.607，P<0.05）和腦脊液葡萄糖含量（t=-2.825，P<0.05）上有統計學差異，說明細菌載量越高，腦脊液白細胞數和蛋白含量越高，而葡萄糖含量越低。 值得注意的是，二者在外周血白細胞計數上也有差異（t=2.313，P<0.05），這在無法得到腦脊液標本而僅能得到外周血標本的病例中有提示意義，外周血白細胞含量高（>1010）的病例其CSF 細菌載量也高。另外，CRP 含量“低 Ct 值組”與“高 Ct 值組”間差異無統計學意義（t=1.950，P>0.05）。 本文針對后遺癥發生率較高的肺炎鏈球菌性BM 進行研究，該細菌引起新生兒細菌性BM 的比例較低，因此僅納入10例培養陽性和5 例培養陰性，后續可收集更多的標本以得到更多數據進行統計分析，可得到更客觀真實的結果。

FQ-PCR 檢測快、敏感度高、定量精確且重復性好[12]，能夠實時動態監測，是一種很好的檢測方法，但本研究僅探討了肺炎鏈球菌引起的腦膜炎，其他病原菌感染是否也存在上述現象，在其他年齡段兒童中是否有不同的表現仍需進一步探討。

本研究表明腦脊液培養陽性率與細菌載量有關，需達到103CFU/ml 以上；細菌載量越高，發熱表現越明顯，腦脊液相關實驗室檢查值越高，說明病情越嚴重，預后越差；實時FQ-PCR 可用于新生兒細菌性BM的快速診斷，其定量結果對患兒臨床表現、預后及轉歸具有提示作用。