肝纖維化指標(biāo)與病毒載量、病理炎癥分級及纖維化分期的關(guān)系

申可，吳國標(biāo)，吳彩虹，陳堅(jiān)平，劉自光

南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院）病理科，廣東佛山 528300

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們的生活方式與飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，這使得各種肝臟疾病的發(fā)病率也越來越高，相關(guān)的肝臟疾病病理研究也在不斷深入[1]。現(xiàn)階段的研究顯示，在肝纖維化的診斷上，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸（HA）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、板層素（LN）以及Ⅲ型前膠原（PCⅢ）等纖維化指標(biāo)與肝纖維化存在一定的相關(guān)性[2]。為探討各種肝纖維化指標(biāo)同疾病炎癥程度、病毒含量以及病理纖維化之間的相關(guān)性，本次研究納入2015年1月—2021年7月南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院收治的164例肝纖維化患者為研究對象，采集血液并離心分離血清，實(shí)施乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA的定量測定，同時(shí)還對一部分的病例實(shí)施肝細(xì)胞活檢檢查，測定相關(guān)的肝纖維化指標(biāo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的164例肝纖維化患者進(jìn)行回顧性分析，其中男112例，女52例；年齡7～83歲，平均（51.12±2.45）歲；慢性肝炎輕度66例，慢性肝炎中度53例，慢性肝炎重度31例，肝硬化14例。遵循自愿原則，根據(jù)患者意愿并結(jié)合臨床指標(biāo)排除存在肝組織穿刺活檢禁忌證患者，有84例患者進(jìn)行肝組織穿刺活檢。針對HBV-DNA含量進(jìn)行分組，細(xì)分為≤1 000、1 000～3 999、4 000～9 999、≥10 000；并根據(jù)炎癥活動(dòng)度及纖維化程度將患者分成1～4級（G）和1～4期（S）。見表1。

表1 慢性肝炎分級、分期標(biāo)準(zhǔn)

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《肝病診療指南》[3]的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；HBV感染者；病例資料齊全，具備正常溝通、交流能力患者；自愿參加研究并且簽署知情同意書的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、腎等器質(zhì)性疾病者；合并惡性腫瘤疾病者；合并血液系統(tǒng)疾病及免疫疾病者；合并精神疾病及認(rèn)知功能障礙者。

1.3 方法

按照無菌及標(biāo)準(zhǔn)原則，采集所有患者的靜脈血液標(biāo)本，將采集的血液加入到肝素抗凝管中，以3 000 r/min的速度持續(xù)離心15 min分離血清。針對HBV-DNA的檢測，具體應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）法測定，具體操作如下：應(yīng)用PCR熒光探針法檢測血清HBV DNA載量，儀器購自湖南圣湘生物科技有限公司，儀器型號為ABI7500。在各PCR反應(yīng)管均加入5 μL的核酸釋放劑，同時(shí)加入5 μL待檢測的血清樣本，吸打3～5次后充分混勻，間隔時(shí)間＞10 min，在2 000 r/min的離心機(jī)中持續(xù)離心30 s，之后將反應(yīng)管置于擴(kuò)增儀中，設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下：50℃2 min，94℃ 5 min，94℃ 15 s，57℃退火、延伸及熒光采集循環(huán)45次，之后在25℃下冷卻10 s，借助擴(kuò)增曲線獲得定量檢測結(jié)果。

肝組織活檢則是應(yīng)用雙人操作經(jīng)皮肝穿刺法獲取肝組織，經(jīng)HE染色以及網(wǎng)狀纖維染色判定結(jié)果。采取化學(xué)發(fā)光法測定血清HA、Ⅳ-C、LN以及PCⅢ指標(biāo)水平，檢測所用的試劑均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。結(jié)果均由資深病理醫(yī)師根據(jù)雙盲隨機(jī)原則按GS分級分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，統(tǒng)一進(jìn)行閱片，在光學(xué)顯微鏡下對病理情況進(jìn)行觀察。

1.4 觀察指標(biāo)

比較不同HBV-DNA含量、不同病理炎癥分級、不同病理纖維化分期患者的血清肝纖維化指標(biāo)[透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）、Ⅳ型膠原（IV collagen, Ⅳ-C）、板層素（laminin, LN）以及Ⅲ型前膠原（procollagen Ⅲ, PCⅢ）]水平，并分析肝纖維化HBV-DNA含量、病理炎癥分級、肝纖維化分期與血清肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示；相關(guān)性分析采用Pearson分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較

不同HBV-DNA含量患者血清肝纖維化指標(biāo)水平對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 [(),μg/L]

表2 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 [(),μg/L]

病毒含量HBV-DNA（+）（n=164）≤1 000（n=47）1 000～3 999（n=52）4 000～9 999（n=30）≥10 000（n=35）HA 161.99±266.23 189.07±281.96 139.51±270.07 153.87±231.77 168.56±276.61Ⅳ-C 114.52±155.43 123.53±185.93 96.61±94.20 114.05±133.31 129.61±200.61 LN 80.63±79.94 65.25±60.10 73.70±69.73 103.03±108.98 90.07±84.09 PCⅢ15.16±10.23 16.73±10.93 14.30±8.58 13.03±8.79 16.26±12.40

2.2 不同病理炎癥分級患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較

不同肝纖維化病理炎癥分級患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同病理炎癥分級患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 [(),μg/L]

表3 不同病理炎癥分級患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 [(),μg/L]

注：與G1期比較，aP＜0.05；與G2期比較，bP＜0.05；與G3期比較，cP＜0.05；與G4期比較，dP＜0.05

分級G1（n=8）G2（n=32）G3（n=32）G4（n=12）PCⅢ16.97±13.97 13.69±8.68 12.91±5.64（18.53±9.05）c HA 62.16±30.88 52.66±18.72（87.10±54.74）b（321.55±223.09）abcⅣ-C 38.31±16.90 44.63±22.54（70.23±36.61）ab（258.15±152.25）abc LN 29.77±16.27 36.93±22.72（46.26±16.96）a（133.67±55.07）abc

2.3 不同病理纖維化分期患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較

不同病理纖維化分期患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同病理纖維化分期患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 [(),μg/L]

表4 不同病理纖維化分期患者的血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 [(),μg/L]

注：與S1期比較，dP＜0.05；與S2期比較，eP＜0.05；與S3期比較，fP＜0.05；與S4期比較，dP＜0.05

分期S1（n=15）S2（n=38）S3（n=16）S4（n=15）PCⅢ14.31±10.42 13.64±8.46 13.74±6.06 17.82±8.59 HA 58.38±27.56 61.00±31.47（96.45±66.18）de（289.23±220.80）defⅣ-C 49.29±29.22 50.77±29.83（69.70±34.17）d（233.49±154.13）def LN 36.89±26.06 42.17±20.04 39.88±14.66（120.03±62.10）def

2.4 肝纖維化HBV-DNA含量、病理炎癥分級、肝纖維化分期與血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的Pearson相關(guān)性分析

患者病理炎癥分級、肝纖維化分期與血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；而HBVDNA含量與肝纖維化指標(biāo)無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見表5。

表5 肝纖維化HBV-DNA含量、病理炎癥分級、肝纖維化分期與血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的Pearson相關(guān)性分析

3 討論

HBV感染疾病的自然進(jìn)程主要分成免疫耐受期、免疫清除期、非活動(dòng)復(fù)制期以及再活動(dòng)期，在受到HBV感染后，可引起機(jī)體免疫功能的降低，并且還會(huì)出現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能紊亂等情況，這樣使得疾病發(fā)生發(fā)展[4-6]。處在免疫耐受期時(shí)，HBV DNA復(fù)制活躍，并且在谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase,ALT）水平上表現(xiàn)正常或者是輕度升高的態(tài)勢，肝組織出現(xiàn)輕微的病理變化以及未見炎癥樣壞死情況[7]。處在免疫清除期時(shí)，則可見ALT水平顯著升高，HBV DNA載量降低，肝組織可見炎癥病變。因此對于不同的HBV DNA含量患者，在肝組織上表現(xiàn)出不同炎癥改變情況。

現(xiàn)階段，研究結(jié)果顯示，慢性肝炎患者進(jìn)展到肝硬化需要經(jīng)歷肝纖維化這一過程[8]。針對肝纖維化可通過相關(guān)肝纖維化指標(biāo)HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的測定輔助早期診斷[9]。慢性乙肝是HBV感染性疾病，對此類患者，血清HBV-DNA是一種可以輔助反映乙肝病毒感染最為直接以及可靠的指標(biāo)，主要是HBV在患者體內(nèi)復(fù)制活躍，會(huì)激活自身免疫應(yīng)答，而免疫應(yīng)答會(huì)間接引起肝細(xì)胞功能的損傷，對此進(jìn)行此類指標(biāo)的測定具有積極意義。

本研究結(jié)果顯示肝纖維化患者血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ同HBV-DNA的含量無明顯相關(guān)性（P＞0.05），這一結(jié)果提示，肝硬化的發(fā)生發(fā)展過程，侵入機(jī)體的乙肝病毒數(shù)量以及復(fù)制能力同病變無明顯關(guān)聯(lián)。而對84例患者進(jìn)行肝組織病理活檢，判定患者病理炎癥分級及纖維化分期，應(yīng)用到GS分級評價(jià)方式，GS分級是根據(jù)病理活檢的組織切片進(jìn)行診斷分級分期的，G是炎癥程度分級，S為纖維化程度分期。本研究結(jié)果顯示，根據(jù)不同肝纖維化病理炎癥分級，不同病理纖維化分期患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示肝纖維化指標(biāo)可以用于評價(jià)慢性乙肝炎癥程度及病理纖維化情況。本次研究結(jié)果顯示，肝 硬 化 者 HA 為（289.23±220.80）μg/L、IV-C 為（233.49±154.13）μg/L、LN 為（120.03±62.10）μg/L、PCⅢ為（17.82±8.59）μg/L，與其他分期肝纖維化指標(biāo)水平對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；張晶[10]的研究顯示，肝硬化者HA為（148.45±61.21）ng/mL、PCⅢ為（141.26±47.02）μg/L，LM、HA、PCⅢ指標(biāo)隨著患者肝纖維化程度加重和炎癥活動(dòng)度加重而呈現(xiàn)升高趨勢，這一結(jié)果與本研究結(jié)果類似。對于慢性乙肝患者，在臨床診斷上，可以加強(qiáng)對相關(guān)生化指標(biāo)的測定。在具體測定上，HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ可以反映出肝纖維化的情況，其中HA屬于一種酸性黏多糖，1934年首次從牛眼玻璃體中分離出這一物質(zhì)，該物質(zhì)有獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)以及理化特性，這樣使得其具有多種生理功能，比如潤滑關(guān)節(jié)及調(diào)節(jié)血管壁的通透性，使水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合[11-12]。Ⅳ-C屬于基底網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)重要組成成分，在細(xì)胞內(nèi)合成能直接以前膠原的形式參與細(xì)胞外間質(zhì)組成，在肝臟纖維化的時(shí)候早期可見其增生，轉(zhuǎn)換快，之后以持續(xù)沉積的層粘連蛋白構(gòu)成完整基底膜。LN是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)的非膠原糖，在肝內(nèi)主要是由內(nèi)皮細(xì)胞以及貯脂細(xì)胞合成，可同膠原一同構(gòu)成基底膜成分，主要作用是同多種基底膜成分進(jìn)行結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長以及細(xì)胞的分化[13-15]。PCⅢ主要是可反映出肝內(nèi)Ⅲ型膠原的合成，PCⅢ水平的持續(xù)升高可表現(xiàn)出病情的持續(xù)性變化，而PCⅢ下降甚至正常可預(yù)示病情的緩解，如此也表明PCⅢ用于評估纖維化有重要意義，且能輔助醫(yī)師判定疾病嚴(yán)重程度，指導(dǎo)對疾病的合理治療，最大限度的保證患者生命健康[16]。本次研究也進(jìn)行相關(guān)性分析，顯示病毒載量同肝纖維化指標(biāo)無顯著相關(guān)性（P＞0.05），而疾病病理炎癥分級及纖維化分期與肝纖維化指標(biāo)呈正相關(guān)（P＜0.05），表明測定肝纖維化指標(biāo)可評估疾病病理分期及分級情況，從而為疾病的治療提供一定參考借鑒。

綜上所述，針對慢性乙肝及肝硬化，在病變的發(fā)展期間，通過測定肝纖維化HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ相關(guān)指標(biāo)，可以預(yù)測疾病病理炎癥分級及纖維化分期情況，輔助對疾病的有效治療。