不同復合支架負載間充質干細胞外泌體應用于骨組織再生的研究進展

歐陽仁俊 綜述 楊曉紅 審校

1.遵義醫科大學口腔醫學院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫科大學附屬口腔醫院口腔修復科，貴州 遵義 563000

骨骼受損后骨的修復與再生都涉及細胞因子、細胞內外基質的復雜整合[1]，骨質缺損后伴有延遲愈合或不愈合，并發展為較大的骨缺損時，傳統的修復手段已不能很好的恢復這一缺損。近年來，外泌體的應用越來越廣泛，若采用生物支架材料負載間充質干細胞來源的外泌體可以更好的修復骨缺損，促進骨的修復與再生，獲得更好的治療效果。現就不同復合支架材料負載間充質干細胞外泌體應用于骨組織再生的研究進展予以綜述。

1 骨組織缺損與修復

骨是一種高度血管化的器官，骨骼系統受到外界刺激后作出一系列的反應[2]。若骨質缺損后伴有延遲愈合或不愈合，并發展為較大的骨缺損時，傳統的修復手段已不能很好的恢復這一缺損。自體骨移植物本質上具有骨傳導性和骨誘導性[3]，通常被認為是修復骨缺損的金標準[4]；但它的使用有許多限制，包括供體部位所提供的骨量不足、術后可能導致供體部位出現并發癥；受體部位相對較高且難以預測的自體吸收等。于是，異體骨移植成為另一種選擇，異體骨移植物依舊保持著骨傳導特性，并在一定程度上具有骨誘導性，但它可能成為疾病傳播的媒介或細菌感染的載體[5]。若采用諸如生物活性玻璃和陶瓷等材料代替缺損部位實現骨傳導，一定程度上能夠恢復骨結構和功能，且成本較低，免疫原性小，安全便捷，但是普通生物材料往往缺乏骨誘導活性，對患者自身的骨沒有實質性的促進再生作用[2]。

相較于傳統的組織修復手段，基于細胞、分子水平的再生技術正在不斷改進，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)對組織的修復作用表現在可以在體外誘導刺激分化為實質細胞以替代受損部位，但其存在不可逾越的倫理學問題[6-7]，而MSCs的致瘤性、潛在的疾病傳播風險和可能存在的免疫排斥反應阻礙了它在骨組織再生中前進的腳步。外泌體(exosomes，Exos)是細胞通過旁分泌作用產生的一種細胞外囊泡，在細胞間傳遞生物信號。Exos多為納米級，呈碟形，直徑為40～160 nm。Exos可以為膜蛋白提供天然的膜環境，有助于維持其穩定性和生物活性，從而有助于提高膜蛋白治療劑的治療效率[8]。其次，Exos中包含著多種物質，如RNA和蛋白質[9]。它表達親代細胞類似的功能[10]又可作為納米載體傳遞活性因子或小分子物質，在細胞的自分泌和旁分泌信號傳導中都起著重要作用。

2 支架材料負載外泌體

生物材料會影響相鄰細胞之間的細胞間通訊，從而顯著加速組織再生，因為這些囊泡可以從患者的細胞中分離出來，避免了免疫原性對后續治療的影響，支架作為Exos和其攜帶生物因子的載體，在極大程度上影響著多種因子的活性。理想情況下，骨支架材料應模仿天然骨細胞外基質的特征和特性，為細胞黏附、遷移、增殖、成骨分化提供適當的生物力學支持和生化環境[4]。良好的支架材料本身應具有(1)“匹配同稱”，具有良好的生物相容性，不引起機體免疫排斥和炎癥激惹；(2)“剛柔并濟”，具有良好的可塑性與一定的機械強度，能為缺損部位的骨組織提供足夠支撐；(3)“四通八達”，具有三維多孔結構、合適的孔徑大小與高孔隙率；(4)“無毒無害”，具有良好的生物可降解性，其降解產物無毒性，降解速率須與骨再生速率相匹配；(5)“平復如故”，具有骨傳導性和骨誘導性，恢復骨缺損部位的結構和功能，能加速骨質沉積、促進骨的生長；(6)“得天獨厚”，具有良好的界面微環境，能促進細胞的黏附、增殖與分化；(7)“不拘一格”，來源不受限制，易獲得且易消毒。

Exos衍生療法由于其獨特的調節和治療特性以及非細胞參與而使并發癥最小化，其臨床轉化潛能顯而易見[11]，向患有牙周炎的小鼠體內局部注射Exos可顯著減輕炎癥和修復牙槽骨破壞[12]。利用人臍帶沃頓氏膠來源的Exos可增強并促進骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchyml stem cell，BMSCs)的遷移和增殖以及軟骨細胞的分化，促進蛋白多糖和膠原蛋白(尤其是Ⅱ型膠原蛋白)的分泌，抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達[13]。

2.1 孔隙率對外泌體釋放的影響當機械性能得到滿足時，使用高孔隙率值(超過90%)能獲得更好的效果，在對大鼠橈骨缺損模型的研究中[14]所采用的聚己內酯(polycaprolactone，PCL)外泌體復合支架，其微孔結構孔徑約為250 μm，該結構能夠很好的模擬骨小梁構成，利于營養物質和氧氣的交換以及新生血管的形成。魏松喬等[15]將絲素與殼聚糖以質量比為5：5的比例混合制備支架，其結構呈現穩定的多孔網狀，方便細胞的長入和Exos發揮效能。支架表面孔隙率的高低和微觀納米形態直接影響細胞的功能[16]。骨再生過程需要營養物質，生長因子從外部持續流入支架的核心。介孔生物活性玻璃分級支架的微米級孔隙率為0.5～2 μm，能提供更高的比表面積為Exos負載提供保護，使冷凍干燥的Exos均勻分布在微孔的內表面，并維持其球形顆粒結構和生物活性[17]。CHEN等[18]發現骨關節炎中軟骨細胞的線粒體損傷會影響ATP的合成，致使軟骨細胞的合成與代謝均受影響。將間充質干細胞衍生的外泌體(mesenchymal stem cells exosomes，MSCs-Exos)與脫細胞軟骨和甲基丙烯酸明膠水凝膠復合成生物墨水，通過桌面立體光刻技術進行高分辨率光交聯生物材料打印，該復合支架中的Exos可以通過補充線粒體相關蛋白來修復退行性軟骨中的線粒體功能障礙和氧化應激損傷；支架則有效增強軟骨細胞遷移。

2.2 材料對外泌體釋放的影響Exos在復合支架中如何長效保存及釋放也是值得研究的熱點問題，Exos起源于細胞的多泡分裂，雖具有很高的治療潛力但隨著時間的推移，Exos在缺陷部位的生物活性和穩定性也會發生改變[19]。與Exos的全身給藥不同，Exos的局部釋放能夠帶來更好的治療效果，Mohammadi[20]表示MSCs-Exos受控釋放時可以有效預防或延遲宿主對植入物的排斥反應。現有研究證實光敏水凝膠——明膠甲基丙烯酰(Gelatin methacryloyl，GM)水凝膠具有水合3D微環境以及支持細胞黏附的能力，可有效結合和改善生物活性因子并穩定其局部濃度，利用甲基丙烯酰明膠(Gelatin methacryloyl，GelMA)-納米黏土鋰皂石(laponite，LAP)GelMA-LAP水凝膠作為一種新的骨修復策略來改善Exos的局部保留和控制遞送[21]，同時水凝膠中的鋰皂石可以幫助延緩Exos的釋放。若將硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，OCS)引入GM水凝膠中，GM-OCS水凝膠的雙重網絡框架可確保Exos的持續釋放，其抗炎作用還可以改善局部微環境，促進細胞的合成代謝[22]。水凝膠應用于Exos緩釋主要是在非承重區域，羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)具有與天然骨礦物質相似的物理結構，被認為是與水凝膠結合形成骨修復復合支架的理想材料。YANG等[23]將HAP與透明質酸-海藻酸鹽水凝膠系統相結合，可在大鼠骨缺損處持久保留Exos并實現受控Exos遞送和一定的力學支持。Exos修飾為水凝膠的常用方法是直接混合，其可能存在負載效率低、外泌體結構破壞、阻礙外泌體成骨潛力等缺點。為了克服這些限制，由兩條或更多肽鏈組成的多功能融合肽在藥物遞送方面表現出優異的能力[24]。融合肽可以增強Exos的保留和穩定性，由小腸黏膜下層和BMSCs-Exos組成的可注射熱敏水凝膠，結合帶有兒茶酚基團的丙酸改善其力學性能。丙酸使水凝膠變得更加致密，三級結構被整合，兒茶酚基團可以與水凝膠中的膠原分子相互作用，在膠原分子之間形成交聯網絡，進一步增強水凝膠的力學性能。LI等[25]將外泌體固定于肽修飾的黏合水凝膠上并局部植入，以此實現外泌體的有效保留、釋放和整合。聚乳酸-乙醇酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)作為一種可降解的生物共聚物，因其可調節的降解速率和安全地降解副產物而廣泛用于控釋系統。劉寧[26]通過提取軟骨細胞分泌的Exos聯合PLGA-HA梯度復合支架，對新西蘭大白兔關節軟骨損傷進行修復。SUN等[27]開發了一種基于絲素蛋白的冷凍海綿，實現MSCs-Exos的長期穩定釋放并維持生物學活性，以及支架降解。外泌體被絲心蛋白鏈緊緊包裹，并保持了它們的膜完整性，使得外泌體的釋放完全依賴于酶促支架的降解。同時體內實驗表明，Exos在未消化的海綿材料中可保留兩個月之久。SWANSON等[28]將源自人牙髓干細胞的外泌體(human dental pulp stem cells exosomes，hDPSCs-Exos)利用微流體裝置封裝在聚乳酸-乙醇酸共聚物結合聚乙二醇(poly ethylene glycol，PEG)所形成的三嵌段微球中，并使用聚多巴胺(polydopamine，pDA)進行表面改性以修復小鼠顱骨缺損，hDPSCs-Exos可將內源性細胞募集到缺損處并促進它們的分化，刺激缺損部位骨組織再生。pDA改性后的PLGA支架可以更好的黏附、攜帶和保留Exos，使Exos可以局部緩慢釋放[29]。不同的材料憑借其自身特性影響外泌體作用的效能，選用合適的負載材料可以進一步增強外泌體在骨組織缺損上的治療效果。

3 支架材料應用于骨組織缺損

3.1 凝膠材料在復合支架中的應用游離在體液中的Exos容易被宿主細胞吞噬而無法發生效應[30]，這會限制Exos本身的作用，采用諸如透明質酸、殼聚糖和聚乙二醇這類生物醫學水凝膠則可以在一定程度上解決這一問題，水凝膠憑借其優越的生物相容性、生物降解性、封裝能力和三維多孔結構得到廣泛應用。透明質酸鈉保濕能力卓絕，在組織損傷和組織修復方面發揮著重要作用。透明質酸水凝膠可起到了良好的載體作用，將臍帶來源的Exos封裝于水凝膠內，并植入缺損部位，可促進細胞的增殖、遷移和血管生成[31]；將牙髓干細胞來源的Exos負載于殼聚糖水凝膠中并局部注射至小鼠體內，則可緩解其牙周炎的快速進展[32]；使用水凝膠材料搭載脂肪來源的間充質干細胞外泌體(adipose-derived mesenchymal stem cells exosomes，AMSCs-Exos)可促進骨再生[33]并獲得更好的治療效果[34]。明膠水凝膠和纖維蛋白交聯改性后可獲得良好的三維空間結構，以此延長Exos作用的時間，更好地促進牙髓細胞的組織再生[35]。可注射黏附性多功能多糖基敷料[36]以溫敏性、可注射性、自愈性和黏附性的多糖基水凝膠支架作為基礎，負載AMSCs-Exos，能促進細胞快速增殖、肉芽組織形成、膠原沉積、重塑和再上皮化。源自誘導多能干細胞的MSCs所分泌的Exos可以促進卵巢切除術后大鼠顱骨缺損處的骨再生和血管生成，其對骨增殖的促進效果隨著Exos濃度的增加而增加[37]。殼聚糖-明膠-硫酸軟骨素冷凍凝膠支架[38]中殼聚糖是糖胺聚糖的類似物，已被證明可促進人類軟骨細胞的生長，而明膠作為水解膠原蛋白，可幫助細胞附著。兩者均可以自凝膠化，進一步增強支架穩定性。

3.2 聚己內酯在復合支架中的應用聚己內酯(polycaprolactone，PCL)是一種具有良好生物相容性和降解性的高分子有機聚合物，在組織缺損修復中可作為良好的支撐材料，具有出色的韌性和機械強度[39]。負載阿司匹林的脂質體與骨形成肽-1組合后并結合在PCL支架上，可以刺激MSCs的成骨分化，還可以協同促進新骨的形成[40]。若將PCL與Exos結合使用，會帶來更好的修復效果，通過結合S-亞硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione，GSNO)和MSCs-Exos[41]，構建具有免疫調節潛力的PCL支架，可顯著減輕巨噬細胞刺激的炎癥并在一定程度上加速了MSCs的成骨分化。但PCL支架相對生物惰性，導致治療效果不理想；濃度為2.5 μg/mL的銀納米顆粒可通過自噬調節增加MSCs的成骨分化和礦化[42]，銀納米顆粒的膠原蛋白支架可以促進骨再生并誘導體內骨折間隙的早期閉合[43]，低劑量的銀納米顆粒結合PCL支架可以增強BMSCs的成骨分化。

3.3 鈦合金材料在復合支架中的應用鈦及鈦合金[44]憑借自身良好的生物相容性和機械性能，在臨床種植材料中脫穎而出，成為應用最廣泛的硬組織支架之一[45]。將透明質酸鈉、海藻酸鈉凝膠分別制備成水凝膠負載Exos，并配合高強度的鈦合金材料以修復骨缺損可以取得良好的效果[46]，用骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)刺激巨噬細胞后獲得外泌體與單尺寸的鈦納米管進行整合，與骨質疏松患者的BMSCs共培養后發現，該BMSCs的堿性磷酸酶和BMP2的表達顯著增強，可有效促進BMSCs的成骨能力[47]。通過支架負載Exos以增強軟骨細胞的增殖和遷移。先前許多的體外和體內研究表明，鈦合金可以促進成骨和骨整合[48]，且具有更高的彈性模量和生物惰性，但單純使用鈦合金作為植入物可能會導致應力屏蔽和骨植入物界面效應，導致骨吸收和纖維組織包封。有研究指出，Exos與多孔鈦合金結合可以有效提高鈦合金支架在骨修復中的功效[49]。隨著3D打印技術的發展，可以制備具有精確空間構型的多孔鈦(porous Ti，pTi)合金。一方面，植入物可以與缺損部位完美匹配。另一方面，合適的多孔結構可以有效促進骨組織向內生長，從而增加植入物的骨結合。最重要的是，多孔結構可以有效降低鈦基合金的彈性模量，減少應力屏蔽。WU等[49]使用(710±42)mm的大孔徑和(68±5.3)%的孔隙率來促進體內成骨和骨整合，用鎂和羥基磷灰石對鈦合金進行表面改性可有效提高鈦合金的生物活性。將雪旺細胞衍生的外泌體均勻摻雜到人工基底膜中，將此膜注入多孔pTi支架的孔隙中可以有效提高鈦合金的生物活性。

4 展望

Exos復合支架的應用為骨組織修復和再生帶來新的啟示，其與組織損傷后相關的抗炎和促炎息息相關，然而，負載間充質干細胞外泌體的復合支架材料其實際臨床應用仍然存在許多障礙。例如，支架材料與Exos如何更好的結合，復合支架在體內所處的環境如何影響Exos的效能，復合支架如何做到極速釋放或緩慢釋放，釋放量的可控性和釋放部位的選擇性都是亟待解決的問題，其次Exos修復和再生背后的分子機制尚未完全闡明，更值得深入探究。本課題組致力于頜骨骨髓間充質干細胞和腫瘤來源外泌體方面的研究。前期研究發現頜骨來源的BMSCs具有更高增殖特性，通過對頜骨來源的BMSCs的miRNAs表達譜篩選、驗證和miRNAs調控機制的探討，發現引起頜骨骨髓間充質干細胞的miRNAs差異性表達的原因是關鍵免疫因子發生了改變，進而導致了miRNAs前體的成熟，影響了miRNAs的差異性表達，另一方面，課題組發現Exos在腫瘤的發生發展、轉移等方面具有促進作用。課題組將在試驗基礎上進一步研究負載頜骨來源的BMSCs-Exos支架材料的生物學性能及其表征，以及其對骨缺損的修復作用。總體而言，對生物材料負載Exos修復骨缺損的研究，將為再生醫學中的無細胞治療提供更多新思路和新見解。