miR-183通過抑制CAND1促進前列腺癌病理進程

張國穎 李俊 白宇 畢城偉 李瑞乾 趙斌

(昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科,云南 昆明 650118)

前列腺癌具有早期不易察覺，預后性差等特點〔1〕，因此尋找有效的分子標記物指導早期診斷治療是現階段前列腺癌臨床研究熱點。Cullin-associated NEDD8-dissociated(CAND)1，是一種人體內由CAND1基因編碼的蛋白質，已證實與細胞內蛋白質泛素化有關系〔2〕，有研究稱蛋白質泛素化參與調節(jié)多種細胞生理功能，包括前列腺癌的許多疾病中均有發(fā)現蛋白質泛素化在細胞內的積累〔3，4〕。miRNA是長 21～23 nt 的一種非編碼 RNA，它通過調控基因的表達，在腫瘤中抑癌或促癌作用〔5〕。多種研究表明，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中miRNA起著重要的作用，但是miR-183在前列腺癌中的作用尚未闡明，本研究檢測了miR-183在前列腺癌患者中的表達，并探究miR-183是否通過調控CAND1從而影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，并有可能為前列腺癌診斷與預測提供新靶點。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2014年2月至2018年4月昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院云南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科收治的前列腺癌患者88例，平均年齡(66.28±14.91)歲，采集已被病理學檢查證實的前列腺患者的癌組織及匹配的癌旁正常組織，-80℃保存，所有患者未接受任何治療、放療及化療。

1.2細胞培養(yǎng)與轉染 在含10%的胎牛血清(FBS)和100 U/ml青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類前列腺癌細胞系PC3、Tsu-Pr1、DU145、M12、22RV1及LNCAP。在含50 mg/L的牛腦垂體提取物(BPE)、5%L-谷氨酰胺及5 μg/L上皮生長因子(EGF)的角質形成細胞無血清培養(yǎng)基(KSFM)中培養(yǎng)對照組非腫瘤前列腺上皮細胞系人正常前列腺上皮細胞(RWPE)-1細胞。使用LipofectamineTM3000 轉染試劑分別向對數期RWPE-1細胞中轉染negative control miRNA、miR-183 mimics、miR-183 inhibitor mimics、miR-183 mimics+CAND1。

1.3采集外周血 采集患者靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，隨后將血漿與血細胞分別裝到無RNA酶的EP管中，在低溫(-80℃)冰箱中保存待用。

1.4定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 按照Trizol試劑盒說明書中步驟提取總RNA，按照反轉錄試劑盒的說明書將總RNA進行RNA逆轉錄，合成cDNA。按照qRT-PCR 試劑盒說明書進行PCR。

1.5熒光素酶報告基因法 構建CAND1熒光素酶質粒：野生型 pMIR-WT和突變型質粒pMIR-Mut。通過miRNA靶點數據庫targetscan對miR-183潛在的靶基因進行預測，為了驗證miR-183是否可靶向調控CAND1，將miR-183 mimics，negative control miRNA mimics(Ncontrol)，miR-183 inhibitor，野生型CAND1質粒及突變型CAND1質粒共轉染進PC3細胞中，使用熒光素酶報告基因法檢測各組熒光素酶活性。

1.6Western印跡 采用RIPA裂解液提取細胞或組織蛋白，遵照二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，加入緩沖液后變性蛋白。按每泳道以50 μg蛋白進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入一抗CAND1抗體(1∶500)，內參GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。電化學發(fā)光(ECL)液暗室發(fā)光顯影，采集圖像并分析。

1.7Transwell小室 將轉染后的前列腺癌PC3細胞調整細胞密度為1×106個/ml。在上室加入100 μl細胞懸液；在下室加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基；置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室后用磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗3次；將小室置于95%乙醇中固定 5 min；在0.5%結晶紫染色液中染色10 min后，用 PBS 漂洗去除未結合細胞的染色液。用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細胞，在顯微鏡下觀察濾膜下層細胞。

1.8CCK8實驗 用培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，按1×104個/孔接種于96孔板，每孔200 μl細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，參照CCK-8試劑盒操作說明書操作向每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1～2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

1.9細胞劃痕實驗 空白對照組和miR-183 mimics轉染組和miR-183 mimics+CAND1轉染組的前列腺癌PC3細胞轉染48 h后，將單細胞懸液接種于12孔細胞培養(yǎng)板。當細胞匯合度達到80%～90%時，用200 μl的移液器槍頭在正中央位置劃一直線，形成單層細胞間的劃痕。將細胞培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.10流式細胞術檢測細胞周期 轉染后細胞PC3細胞用預冷的PBS重懸，70%乙醇固定，4℃過夜。去除乙醇后，用PBS洗滌2次并加入100 μl RNaseA，37℃水浴30 min，接著添加400 μl PI染色并混勻，4℃避光30 min，最后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.11統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結 果

2.1miR-183在前列腺癌患者組織和各細胞株中的表達量 miR-183在前列腺腫瘤組織中表達量(6.22±1.25)明顯較癌旁正常組織(5.56±0.50)升高。miR-183在多種前列腺癌細胞株(PC3、Tsu-Pr1、DU145、22RV1、LNCAP)中的表達量(3.92±0.37、4.52±0.44、4.52±0.45、3.05±0.29、3.32±3.30)與RWPE-1(1.00±0.00)相比均顯著升高(均P<0.05)。miR-183可能參與前列腺癌的細胞調節(jié)功能，導致表達異常。

2.2前列腺癌患者臨床病理特征及外周血中miR-183的表達量 Glcason評分>7的患者顯著高于Glcason評分≤7的患者，TNM分期越高的患者表達量顯著越高，淋巴結轉移的患者明顯高于無淋巴結轉移的患者，遠處轉移的患者顯著高于無遠處轉移的患者，前列腺癌危險因素越高的患者表達量越高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同年齡、血清PSA水平的患者miR-183表達量比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 前列腺癌患者的臨床病理特征及血清miR-183的表達量

2.3miR-183通過結合CAND1的 3′-UTR來抑制CAND1的表達量 對于野生型CAND1質粒，miR-183 mimics轉染組熒光素酶活性顯著低于空白對照組，miR-183 inhibitor 轉染組熒光素酶活性顯著高于空白對照組(均P<0.05)。對于突變型CAND1質粒，熒光素酶活性均沒有明顯變化。見表2。雙熒光素酶結果表明miR-183可抑制CAND1的表達。

表2 miR-183通過結合CAND1的 3′-UTR來抑制CAND1的表達量

2.4qRT-PCR及Western印跡檢測miR-183與CAND1的調控作用 qRT-PCR結果顯示，miR-183 mimics轉染組CAND1 mRNA表達量(4.05±1.05)顯著低于空白對照組(5.62±1.13)；miR-183 inhibitor轉染組CAND1 mRNA表達量(7.85±1.85)顯著高于空白對照組。Western 印跡檢測結果也顯示，miR-183 mimics轉染組中CAND1蛋白表達量(3.02±0.93)顯著低于空白對照組(7.55±2.05)，miR-183 inhibitor轉染組CAND1蛋白表達量(10.34±2.12)顯著高于空白對照組(均P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測miR-183與CAND1的調控作用

2.5miR-183與CAND1對PC3細胞增殖、遷移及周期S期相關性 miR-183 mimics轉染組的OD值(1.24±0.09)顯著高于空白對照組(0.76±0.08)，miR-183 mimics+CAND1轉染組的OD值(0.29±0.03)顯著低于miR-183 mimics轉染組。miR-183 mimics轉染組S細胞數、下室細胞數(192.2±11.6、19.5±2.8)顯著高于空白對照組(94.6±6.4、8.1±1.9)；miR-183 mimic+CAND1轉染組S細胞數、下室細胞數(37.3±5.1、7.2±1.1)顯著低于miR-183 mimics轉染組(均P<0.05)。見圖2。

圖2 Transwall侵襲實驗下室結晶紫染色(A,×400)和細胞劃痕實驗(B,×400)

2.6CAND1在前列腺癌腫瘤組織中表達量變化 前列腺癌組織中CAND1 mRNA表達量(3.34±1.88)顯著低于癌旁正常組織(5.55±1.03)。前列腺癌細胞系PC3、Tsu-Prl、DU145、22RV1、LNCAP中CAND1 mRNA表達量(3.92±0.37，4.52±0.44，4.52±0.45，3.05±0.29，3.32±3.30)均顯著低于非腫瘤前列腺上皮細胞系RWPE-1中CAND1mRNA表達量(7.55±2.05)。前列腺癌腫瘤組織中CAND1蛋白表達量(4.07±1.52)顯著低于癌旁正常組織(6.19±1.87，均P<0.05)。見圖3。CAND1對前列腺癌的病理發(fā)展有抑制。

圖3 CAND1在前列腺癌腫瘤組織和癌旁正常組織中mRNA表達

3 討 論

現階段仍然沒有足夠的證據表明使用PSA或前列腺穿刺活檢等常見生物標記物進行篩查可以降低前列腺癌死亡率〔6～8〕。因此需要尋找新的生物標志物用于前列腺癌臨床研究。

miRNAs影響包括增殖、分化、凋亡及細胞周期在內的許多重要的細胞學進程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。研究表明多個miRNAs與已證實前列腺癌發(fā)病進程相關〔9，10〕。Feng等〔11〕研究發(fā)現miR-17-92基因簇可能是前列腺癌潛在診斷和預后生物標志物，而miR-17-92基因簇和血清PSA的組合可以提高前列腺癌診斷的準確性。Kurul等〔12〕發(fā)現在檢測的let-7c，miR-21，miR-145，miR-182和miR-221 五種miRNA中，miR-221與低風險前列腺癌的生化復發(fā)相關性最大。Lu等〔13〕研究發(fā)現miRNA-186通過靶向調控YY1和CDK6來抑制前列腺癌細胞增殖和腫瘤生長。本文結果提示，外周血中miR-183的表達量對不同Gleason評分、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移及危險因素患者的臨床特征是有具備影響的，miR-183有可能成為前列腺癌診斷與預測的潛在生物標志物。miR-183可能參與前列腺癌的細胞調節(jié)功能，導致多項檢測表達水平異常。miR-183有可能成為前列腺癌診斷與預測的潛在生物標志物。

Korzeniewski等〔14〕研究發(fā)現CAND1 mRNA和蛋白質在前列腺癌中表達缺失。本文研究說明CAND1對前列腺癌的病理發(fā)展有抑制影響，而過表達miR-183可抑制CAND1 mRNA翻譯水平及其蛋白表達，促進前列腺癌PC3細胞增殖、遷移及S期的聚集。同時，對miR-183進行抑制后，對CAND1產生抑制作用。

綜上，CAND1對前列腺癌有抑制調控作用，同時過表達miR-183能夠抑制CAND1 mRNA翻譯及其蛋白表達，促進前列腺癌的病理發(fā)展，推測敲低miR-183可能成為前列腺癌診斷及治療的新靶向。