miR-423-5p通過調控UCHL1表達對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞損傷的影響

孫小葉 鄧展峰 常早上

(邵陽學院 1護理學院，湖南 邵陽 422000；2附屬第二醫院五官科；3基礎醫學院)

白內障是嚴重影響人類生活的致盲性疾病，由于人口老齡化的加劇，其發病率明顯升高〔1〕。白內障發病的原因較為復雜，研究顯示，人晶狀體上皮細胞的氧化應激和凋亡與白內障的發生發展密切相關〔2〕，減輕氧化應激引起的人晶狀體上皮細胞凋亡對白內障的治療有重要意義。miR-423-5p是一種微小RNA(miRNA)，在細胞增殖、凋亡、氧化應激等生命過程中發揮重要調控作用〔3〕。研究顯示，干擾miR-423-5p表達可抑制過氧化氫(H2O2)誘導的心肌細胞凋亡，miR-423-5p有可能成為凋亡相關的心臟病治療的新靶點〔4〕。但目前，miR-423-5p對人晶狀體上皮細胞損傷的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，泛素羧基末端水解酶(UCH)L1的3′非編碼區(3′UTR)含有與miR-423-5p互補的核苷酸序列，提示UCHL1可能是miR-423-5p的靶基因。UCHL1是一種泛素化酶，在神經元中大量表達。研究顯示，UCHL1在年齡相關性白內障患者晶狀體上皮細胞中的表達明顯低于正常人，有一定的抗氧化保護作用〔5〕。本研究探討miR-423-5p對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激和凋亡的影響及其是否通過調控UCHL1發揮作用。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人晶狀體上皮細胞細胞購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM培養基、雙熒光素酶活性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒均購自北京索萊寶；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒，美國Invitrogen公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自美國Fermentas公司；PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；UCHL1、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)多克隆抗體均購自美國Abcam公司；miR-144-3p mimics、miR-NC、anti-miR-144-3p、anti-miR-NC、pcDNA-UCHL1、pcDNA、si-UCHL1、si-NC均購自上海吉凱基因公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1細胞培養和轉染 用含10%FBS的DMEM培養基(常規培養基)培養人晶狀體上皮細胞。將對數的人晶狀體上皮細胞接種于6孔細胞培養板中(1×105個/孔)，培養24 h后，棄培養基。利用LipofectamineTM2000試劑盒，分別轉染anti-miR-423-5p、anti-miR-NC、pcDNA-UCHL1、pcDNA、共轉染anti-miR-423-5p與si-UCHL1、anti-miR-423-5p與si-NC。轉染12 h后，更換新鮮培養基。再培養24 h后，RT-qPCR檢測細胞中miR-423-5p或Western印跡檢測UCHL1蛋白表達驗證轉染效果，并收集細胞用于后續實驗。

1.2.2細胞分組 人晶狀體上皮細胞分為對照組：細胞用常規培養基培養；H2O2組：細胞用含100 μmol/L H2O2的常規培養基培養12 h〔6〕。轉染anti-miR-423-5p、anti-miR-NC、pcDNA-UCHL1、pcDNA、共轉染anti-miR-423-5p與si-UCHL1、anti-miR-423-5p與si-NC的細胞均用含100 μmol/L H2O2的常規培養基培養12 h，并分別記為H2O2+anti-miR-423-5p組、H2O2+anti-miR-NC組、H2O2+pcDNA-UCHL1組、H2O2+pcDNA組、H2O2+anti-miR-423-5p+si-UCHL1組、H2O2+anti-miR-423-5p+si-NC組。每組設3個復孔。各組細胞培養結束后，檢測各項指標，實驗重復3次。

1.2.3RT-qPCR檢測miR-423-5p和UCHL1 mRNA表達 用RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，經逆轉錄合成cDNA后，行PCR擴增。miR-423-5p上游5′-TGAGGGGCAGAGAGCGA-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游5′-GCTTCGGCAGCACATATA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；UCHL1上游5′-CTATGAACTTGATGGACGAATGCC-3′，下游5′-GGACTTCTCCTTGCTCACGCTC-3′；GAPDH上游5′-CATCGAGCACGGCATCGTCA-3′，下游5′-TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。用 2-△△Ct法計算miR-423-5p相對U6、UCHL1 mRNA相對GAPDH的表達量。

1.2.4Western印跡檢測蛋白表達 用RIPA試劑提取細胞中總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并在室溫環境中用5 %脫脂牛奶封閉1 h。然后于4℃冰箱中分別用UCHL1(稀釋度1∶800)、Bax(稀釋度1∶500)、Bcl-2(稀釋度1∶500)和GAPDH一抗孵育過夜。洗膜后，在于37℃搖床中用辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗IgG(稀釋度1∶200)孵育1 h。加入顯影液，避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析目的蛋白相對GAPDH表達量。

1.2.5酶聯免疫吸附試驗檢測MDA、SOD和GSH-Px表達 向收集的各組細胞中加細胞裂解液，充分裂解細胞，3 500 r/min離心10 min，取上清。分別利用MDA、SOD和GSH-Px試劑盒，檢測上清中MDA含量及SOD和GSH-Px活性。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)將收集的細胞清洗2次，1 500 r/min離心5 min后，棄PBS，加500 μl結合緩沖液，重懸細胞。加10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加5 μl PI，室溫避光孵育5 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-423-5p與UCHL1靶向關系 將對數期人晶狀體上皮細胞接種于6孔細胞培養板中(1×105個/孔)，培養24 h后，棄培養基。利用LipofectamineTM2000試劑盒，分別共轉染WT-UCHL1與miR-423-5p mimics、WT-UCHL1與miR-NC、MUT-UCHL1與miR-423-5p mimics、MUT-UCHL1與miR-NC。轉染12 h后，更換新鮮培養基。再培養24 h后，加細胞裂解液，充分裂解細胞。3 500 r/min離心10 min，取上清液，利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒，檢測熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海腎的熒光強度比值表示。

1.3統計學方法 利用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-423-5p及UCHL1在H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞損中的表達 與對照組相比，H2O2組miR-423-5p表達顯著升高，UCHL1 mRNA 和蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞中UCHL1蛋白表達

表1 miR-423-5p及UCHLl在H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞中的表達

2.2干擾miR-423-5p對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激的影響 H2O2+anti-miR-423-5p組miR-423-5p表達水平(0.23±0.04)顯著低于H2O2+anti-miR-NC組(1.00±0.08，t=25.827，P<0.05)，表明anti-miR-423-5p轉染成功，人晶狀體上皮細胞中miR-423-5p表達受到干擾。與對照組相比，H2O2組MDA水平顯著升高，SOD和GSH-Px活性均顯著降低(均P<0.05)。與H2O2+anti-miR-NC組比較，H2O2+anti-miR-423-5p組MDA水平顯著降低，SOD和GSH-Px活性均顯著上升(均P<0.05)。見表2。

表2 干擾miR-423-5p對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激的影響

2.3干擾miR-423-5p對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡的影響 與對照組相比，H2O2組細胞凋亡率和Bax蛋白顯著升高，而Bcl-2蛋白顯著降低(均P<0.05)。與H2O2+anti-miR-NC組比較，H2O2+anti-miR-423-5p組細胞凋亡率和Bax蛋白顯著降低，而Bcl-2蛋白顯著升高(均P<0.05)。見圖2、表3、圖3。

圖3 H2O2誘導的干擾miR-423-5p的人晶狀體上皮細胞凋亡流式圖

表3 干擾miR-423-5p對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡的影響

1～4：對照組,H2O2組,H2O2+anti-miR-NC組,H2O2+anti-miR-423-5p組

2.4UCHLl過表達對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞的影響 H2O2+pcDNA-UCHL1組UCHL1蛋白表達水平顯著高于H2O2+pcDNA組(P<0.05)，表明pcDNA-UCHL1轉染成功，人晶狀體上皮細胞中UCHL1過表達。與H2O2+pcDNA組比較，H2O2+pcDNA-UCHL1組MDA水平、細胞凋亡率、Bax蛋白均顯著降低，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白均顯著升高(均P<0.05)。見圖4，表4。

1～4：對照組,H2O2組,H2O2+pcDNA組,H2O2+pcDNA-UCHL1組

表4 UCHLl過表達對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞的影響

2.5miR-423-5p靶向調控UCHL1的表達 生物信息學軟件預測顯示的UCHL1的3′UTR與miR-423-5p互補的結合位點見圖5。共轉染miR-423-5p與WT-UCHL1的人晶狀體上皮細胞熒光素酶活性顯著低于共轉染miR-NC與WT-UCHL1的細胞(P<0.05)，說明miR-423-5p可與UCHL1靶向結合。見表5。轉染miR-423-5p mimics的人晶狀體上皮細胞中UCHL1蛋白表達量(0.24±0.03)顯著低于轉染miR-NC的細胞(0.58±0.05，t=17.493，P<0.05)，轉染anti-miR-423-5p的人晶狀體上皮細胞中UCHL1蛋白表達量(0.97±0.08)顯著高于轉染anti-miR-NC的細胞(0.55±0.05，t=13.356，P<0.05)，進一步說明miR-423-5p負調控UCHL1表達，見圖6。

1～4：miR-NC組，miR-423-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-423-5p組

表5 熒光素酶活性檢測

圖5 UCHL1的3′UTR中含有與miR-423-5p互補的核苷酸序列

2.6干擾UCHL1逆轉干擾miR-423-5p對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞損傷的作用 與H2O2+anti-miR-423-5p+si-NC組比較，H2O2+anti-miR-423-5p+si-UCHL1組UCHL1蛋白、SOD及GSH-Px活性、Bcl-2蛋白顯著降低，而MDA水平、細胞凋亡率及Bax蛋白顯著升高(均P<0.05)。見表6，圖7。

表6 干擾UCHL1逆轉干擾miR-423-5p對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞損傷的作用

1～4:H2O2組+anti-miR-NC組，H2O2組+anti-miR-423-5p組，H2O2組+anti-miR-423-5p+si-NC組，H2O2組+anti-miR-423-5p+si-UCHL1組

3 討 論

晶狀體上皮細胞的氧化損傷在白內障的發病過程中發揮重要作用。氧化應激發生時，機體內的活性氧在晶狀體上皮細胞內過量聚集，氧化代謝物的增加會對細胞產生毒性作用，損傷細胞結構和功能，引起細胞凋亡〔7〕。MDA是脂質過氧化產物之一，其含量高低可反映氧化應激水平〔8〕。生理狀態下，體內的抗自由基損傷酶如SOD和GSH-Px，可清除多余的活性氧，使自由基的產生和清除處于動態平衡〔9〕。晶狀體上皮細胞的凋亡是白內障形成的始動環節和病理基礎〔10〕。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2參與調控細胞凋亡，Bax表達升高會促進細胞凋亡，而Bcl-2表達升高則會抑制細胞凋亡。H2O2常被用于誘導晶狀體上皮細胞建立損傷模型。本研究結果顯示，H2O2誘導后，晶狀體上皮細胞MDA表達水平、細胞凋亡率及Bax蛋白表達升高，SOD和GSH-Px水平及Bcl-2蛋白表達降低，與相關研究結果一致〔11,12〕，說明H2O2刺激細胞產生了氧化應激、細胞受損、凋亡加劇。

miRNA在真核生物中廣泛存在，參與調控人晶狀體上皮細胞損傷。Li等〔13〕研究顯示，miR-34a在H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞中表達升高，其通過下調Bcl-2和沉默信息轉錄調控因子(SIRT)1表達促進人晶狀體上皮細胞凋亡。研究顯示，心肌損傷、糖尿病、腫瘤等疾病中miR-423-5p均異常表達〔14～16〕，miR-423-5p是多種疾病的潛在治療靶點。目前，miR-423-5p對人晶狀體上皮細胞損傷的影響還未知。本研究結果提示miR-423-5p可能參與白內障的發生、發展；干擾miR-423-5p表達可抑制H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激，保護細胞免受H2O2誘導的氧化損傷。同時干擾miR-423-5p還減少了H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡及Bax蛋白表達，并增加了細胞中Bcl-2蛋白表達，說明干擾miR-423-5p表達可抑制H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡。提示miR-423-5p促進H2O2誘導的晶狀體上皮細胞氧化應激和凋亡，其可能是白內障治療的潛在作用靶點。

UCHL1屬于去泛素化酶家族成員，在神經系統分布廣泛。多種病理條件下，UCHL1表達缺失。黃婷等〔17〕研究顯示UCHL1在缺血缺氧腦損傷大鼠海馬組織中表達降低，其對損傷的海馬神經細胞的修復有重要作用。胡雅岑等〔18〕研究顯示，帕金森病模型小鼠黑質腦組織中UCHL1表達降低，UCHL1參與帕金森病的發生、發展。本研究結果提示miR-423-5p通過靶向抑制UCHL1表達促進H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激的凋亡。

綜上，H2O2能夠引起人晶狀體上皮細胞氧化應激損傷和細胞凋亡，而干擾miR-423-5p表達對H2O2誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激和凋亡發揮抑制作用，這可能與miR-423-5p靶向負調控UCHL1表達有關。