尤瑞克林通過MAPK/ERK信號通路改善小鼠腦缺血再灌注損傷

于榮煥 李萬里 張潔晶 張高才 曹金娟 王煥煥

(開封市中心醫(yī)院，河南 開封 475000)

腦梗死具有高發(fā)生率及高死亡率的特點，占腦血管病的50%～80%，嚴重危及患者的生命和健康〔1〕。腦缺血再灌注損傷是指腦缺血完全壞死之前，已閉塞血管再通后缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象。許多病理生理學機制，如氧化應(yīng)激、凋亡、興奮性氨基酸毒性及炎癥，參與甚至調(diào)控腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程，缺血再灌注損傷后產(chǎn)生的眾多的產(chǎn)物激活胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路，進一步導致細胞的凋亡或壞死〔2～4〕。

尤瑞克林(HUK)的主要成分是人尿激肽原酶，通過促進血管緩激肽和血管舒張素的生成達到擴張血管平滑肌的作用。Chao等〔5〕的研究表明人尿激肽原酶能顯著減少腦梗死面積，其機制可能與促進血管內(nèi)皮細胞再生和減少細胞凋亡等有關(guān)，同時可能通過抑制炎癥反應(yīng)及下調(diào)核因子(NF)-κB通路進而對小鼠的腦缺血再灌注損傷起到明顯的保護作用。作者前期研究表明，人尿激肽原酶能夠通過減少凋亡相關(guān)蛋白及增加抗凋亡蛋白進而起到改善神經(jīng)功能的作用〔6〕。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是調(diào)節(jié)腦梗死后炎癥及凋亡的必要的信號通路，主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2、p38和Jun氨基末端激酶(JNK)，通過將細胞外信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)，進而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的分子學水平的變化〔7，8〕。既往研究表明，ERK1/2的持續(xù)活化具有神經(jīng)保護作用〔9，10〕，同時有研究指出，持續(xù)的p38活化具有神經(jīng)損傷作用，甚至導致神經(jīng)細胞的死亡〔11〕。Satoh等〔12〕研究指出給予ERK1/2的抑制劑具有顯著的神經(jīng)保護作用，證明ERK1/2的活化具有神經(jīng)損傷作用。結(jié)合以上研究，ERK1/2可能在神經(jīng)細胞的凋亡過程中具有雙重作用，因此調(diào)節(jié)ERK1/2的活性可能是治療腦梗死的新的研究點。本研究探討HUK對腦缺血再灌注小鼠72 h后細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響及可能的神經(jīng)細胞保護機制，為HUK的臨床應(yīng)用提供可能的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 選用清潔級雄性ICR小鼠60只〔購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2018-0005〕，體重23～25 g，隨機分為假手術(shù)組(16只)，I/R+NS組(20只)，I/R+HUK組(24只)，其中I/R+HUK組小鼠有1只在手術(shù)過程中由于出血死亡，1只在缺血第2天死亡，考慮與麻醉過深有關(guān)。參照文獻〔8〕的給藥方法：用滅菌0.9%氯化鈉溶液稀釋HUK(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)，在缺血30 min前，經(jīng)尾靜脈給予小鼠20×10-3PNAU/kg，并要求在 3 min內(nèi)注射完成，缺血組給予同等劑量0.9%氯化鈉溶液。實驗過程嚴格遵循中華人民共和國科技部辦法的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2小鼠短暫性大腦中動脈阻塞(MCAO) 模型制備參照Zhang等〔13〕的實驗方法制備MCAO模型，具體實驗方法：術(shù)前12 h小鼠禁食不禁水，將小鼠稱重后，給予腹腔注射4%水合氯醛，并按照0.1 ml/10 g劑量進行麻醉。仰臥位固定，常規(guī)絡(luò)合碘消毒，頸部正中切開，依次暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，應(yīng)用縫合線短暫性阻斷頸總動脈血流后，在遠心端結(jié)扎并剪斷頸外動脈，在距頸總動脈分叉處0.5 cm 處剪一小切口，順著頸總動脈插入用硅膠包裹的頭端直徑為0.25～0.35 mm的6-0縫合線，觀察多普勒血流儀，在血流突然下降時停止線栓插入，此時進線長度約10 mm，缺血40 min后拔出線栓，結(jié)扎頸外動脈斷端，縫合皮膚。在手術(shù)過程中，保持小鼠體溫始終維持在37.0℃。假手術(shù)組僅切開頸部皮膚；I/R+NS組給予等比例的生理鹽水；I/R+HUK組給予等比例HUK。

1.3觀察指標

1.3.1神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積測定 參考經(jīng)典的Longa等〔14〕的神經(jīng)功能缺損評分方法，評定手術(shù)72 h后小鼠的神經(jīng)功能缺損情況，具體評分方法如下：0分，無明顯神經(jīng)功能喪失；1分，不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，環(huán)形運動；3分，行走時向左側(cè)傾倒；4分，不能自行行走，意識水平下降。神經(jīng)功能缺損評分結(jié)束后，將小鼠斷頭取腦，將小鼠腦組織放置凍臺上，置于-30℃冰箱快速冷凍后取出依次切片，每層厚度約2 mm，將腦切片置于1% 2，3-氯化二苯四氮唑溶液中(粉末購置于美國Amerco公司)，37℃閉光孵育30 min，并翻轉(zhuǎn)腦片保證充分染色，在數(shù)碼相機下高清拍照，應(yīng)用 AlphaEaseFC軟件評估小鼠腦梗死體積，結(jié)果用腦梗死體積/同側(cè)腦半球面積百分比表示。

1.3.2Western印跡檢測小鼠缺血側(cè)大腦海馬Bcl-2、Bax、ERK1/2蛋白的磷酸化水平 將斷頭后的小鼠腦組織快速置于冰上，小心清晰分離海馬組織，加入同等質(zhì)量比的裂解液，超聲粉碎，冰上放置30 min，4℃ 13 000 r/min離心30 min，取出上清液-30℃冰箱保存?zhèn)溆茫捎?BCA 法測定組織蛋白濃度后制定Western印跡樣品，置于EP管中。電泳、聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂牛奶封閉后一抗4℃冰箱孵育過夜(抗Bcl-2、抗Bax抗體濃度分別為1∶1 000、1∶800，均購自美國Abcam公司；抗ERK1/2抗體及抗p-ERK1/2抗體濃度為1∶1 000，均購自Cell Signaling Technology；抗β-微管蛋白(Tubulin)(1∶5 000；美國Jackson Laboratories公司)。第2天取出蛋白膜PBST洗凈后室溫孵育二抗1 h，然后PBST洗凈后應(yīng)用洗片機顯影。

1.3.3TUNEL染色評估缺血側(cè)海馬組織細胞凋亡程度 將小鼠斷頭取腦后，立即用10%甲醛溶液固定，將腦組織石蠟包埋后進行連續(xù)切片。實驗過程嚴格遵循TUNEL試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)方法，應(yīng)用熒光顯微鏡，在400倍鏡下，每張切片隨機選取3個視野進行圖像采集及結(jié)果分析，顆粒狀綠色深染的細胞為TUNEL 陽性細胞。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HUK對缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能評分及缺血體積的影響 假手術(shù)組腦組織無明顯梗死，I/R+HUK組神經(jīng)缺損評分顯著低于I/R+NS組〔(1.89±0.29)分 vs(2.86±0.26)分，P<0.01〕。I/R+HUK組腦梗死體積顯著小于I/R+NS組〔(0.35±0.05)% vs(0.58±0.02)%，P<0.01〕。見圖1。

A：假手術(shù)組；B：I/R+NS組；C：I/R+HUK組

2.2HUK對缺血再灌注后小鼠神經(jīng)元細胞凋亡的影響 與假手術(shù)組相比，I/R+NS組凋亡細胞顯著增多，I/R+HUK組凋亡細胞的數(shù)量顯著低于I/R+NS組(P<0.01)。見圖2，表1。

圖2 各組凋亡細胞的比較(TUNEL，×400)

2.3HUK對缺血再灌注小鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白的影響 與假手術(shù)組比較，I/R+NS組Bcl-2顯著降低，Bax顯著升高(P<0.01)。與I/R+NS組比較，I/R+HUK組Bcl-2顯著升高，Bax顯著降低(P<0.01)。見表1、圖3。

圖3 各組Bcl-2、Bax蛋白表達

2.4HUK對ERK信號通路的影響 I/R+NS組海馬內(nèi)ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達顯著高于假手術(shù)組，I/R+HUK組ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達較I/R+NS組顯著降低(P<0.01)，見表1，圖4。

表1 各組凋亡細胞數(shù)及Bcl-2、Bax、ERK蛋白表達比較

圖4 各組ERK蛋白表達

3 討 論

缺血性腦損傷是由于大腦血管狹窄或堵塞腦內(nèi)循環(huán)血液的剝奪引起的，具有嚴重的致殘性〔3〕。可以通過不同途徑起到顯著的神經(jīng)保護作用〔15，16〕，既往研究發(fā)現(xiàn)，給予HUK后，小鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀明顯減輕，并且可以促進抗凋亡蛋白的增加，進而起到抗凋亡的作用〔6〕，ERK信號通路是MAPK家族的重要成員，主要參與細胞的凋亡、增殖及分化，主要涉及Raf、ERK、p38MAPK及其他相關(guān)的蛋白表達〔17，18〕。ERK蛋白的活化可以上調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達及Bcl-2蛋白的活化，從而達到腦保護的作用；活化的ERK可以維持線粒體的功能，并能通過磷酸化Bcl-2細胞凋亡調(diào)節(jié)子(Bim)，抑制Bim與Bax結(jié)合，從而抑制凋亡〔19～21〕。

HUK治療缺血再灌注損傷的可能機制是通過下調(diào) ERK1/2蛋白的磷酸化水平，進而通過升高Bcl-2蛋白表達，降低Bax蛋白水平而減少細胞的凋亡，從而達到神經(jīng)保護的作用。本實驗仍存在不足之處，并未對腦梗死小鼠應(yīng)用 ERK抑制劑干預(yù)，后續(xù)研究中會進一步探討HUK在MAPK通路中的其他相關(guān)蛋白水平的變化，進一步研究HUK對于急性腦梗死的作用機制。