不同周齡大鼠血管硬化程度與NF-κB 炎癥信號通路的關系

朱紅俊 陸曙 蘇偉 龔少愚

(南京中醫藥大學無錫附屬醫院心血管科，江蘇 無錫 214071)

對于非高危肺血栓栓塞癥，年齡增長和疾病嚴重程度明顯相關〔1〕；對于前列腺癌患者，不同年齡對疾病的不確定感和生活水平有顯著差異〔2〕。對于動脈粥樣硬化，年齡是獨立的危險因素。動物年齡越大，其血管對高脂血癥損傷也越敏感〔3〕。本研究從核因子(NF)-κB信號通路角度，探討這種現象中炎癥反應的相關機制，證實年齡對炎癥信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只8周齡清潔級雄性SD大鼠由江蘇省血吸蟲病防治研究所動物實驗中心提供和飼養，平均體重(220±20)g。分籠飼養，飼養環境:室溫(22±4)℃,光照與黑暗循環時間為12 h。本研究均采用普通標準飼料喂養，由動物實驗中心提供。

1.2實驗試劑及儀器 20%烏拉坦及Invitrogen Trizol購自中國蘇州碧麗雅生物科技有限公司；柱式細胞和組織總RNA抽提試劑盒購自中國上海博彩生物科技有限公司；淋巴細胞分離液購自中國北京生物技術研究所；無Ca、Mg的Hank液購自中國蘇州科創生物技術有限公司；酶聯免疫吸附試劑盒購自美國Blue Gene公司；LightCycler480聚合酶鏈反應(PCR)儀購自德國 ROCHE。

1.3分組與給藥方法 所有大鼠采用標準飼料喂養，自由飲水。每周稱大鼠體重。適應性喂養1 w后，剔除飼食異常者。在第9周齡、第13周齡、第21周齡，分別隨機抽取10只大鼠，留取外周血、大動脈、心臟組織等實驗標本。

1.4樣品采集與預處理 取樣時，采用20%烏拉坦腹腔注射麻醉。打開腹腔，從下腔靜脈，采用5 ml無菌注射器抽取4 ml靜脈血，分別注入生化管和85 U肝素鋰抗凝的真空采血管各2 ml，根據試劑盒說明書進行外周血單個核細胞分離及RNA提取。留取大動脈(含升主動脈、主動脈弓、降主動脈)、心臟左心室(保留冠狀動脈)心肌組織，0.9%生理鹽水沖洗，分別置入含甲醛1 ml的2 ml凍存管(常溫保存)及不含甲醛的2 ml凍存管，-80℃的冰箱保存待檢。甲醛固定的大血管、左心室組織送至醫院病理科進行取材、包埋。冰凍保存的組織樣本根據試劑說明書進行組織勻漿制備及RNA的提取。

1.5指標檢測 (1)外周血單個核細胞及左心室組織Toll樣受體(TLR)-4 mRNA表達 根據文獻方法〔4〕采用RT-PCR進行，通過溶解曲線、2%瓊脂糖凝膠電泳和基因測序確定產物表達的準確性，TLR-4 mRNA的表達程度采用相對定量計算，以13周齡大鼠檢測值為標準。標準化比值計算公式采用2-△△Ct法〔5〕。檢測方法：管家基因β-actin作為內參基因，大鼠目的基因和內參基因引物序列：TLR-4正義鏈：5′-AGAATGAGGACTGGGTGA-3′,反義鏈：5′-AGCGGCTACTCAGAAACT-3′；β-actin正義鏈：5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′,反義鏈：5′-ACA TCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。(2)血清及左心室組織NF-κB水平、白細胞介素(IL)-6、IL-10水平 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行檢測。檢測流程根據試劑說明書進行。(3)血脂水平 血脂〔總膽固醇(TC)、三酯甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)〕水平檢測，由醫院檢驗科采用氧化還原方法測定。

1.6組織學染色 (1)大鼠主動脈血管厚度 主動脈標本在主動脈弓根部取材，甲醛固定，石蠟包埋，連續切片5個，蘇木素-伊紅(HE)染色。鏡下測量外膜基膜至血管內膜表面的最大垂直厚度。(2)左心室組織多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)-1的表達：采用免疫組化方法進行檢測，檢測方法參考文獻〔6，7〕進行。每個標本在鏡下隨機觀察相互不重疊的視野各4個，計算每個視野陽性細胞均數。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析及Pearson相關性檢驗。

2 結 果

2.1病理及免疫組化檢測結果 大鼠主動脈壁厚度和PARP-1陽性細胞數隨著大鼠周齡增加而增加(均P<0.05)。見圖1，表1。

2.2NF-κB信號通路相關指標 大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB、血清IL-6水平隨著大鼠周齡增加而增加(P<0.05)。大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB水平、血清IL-6水平均和大鼠周齡呈正相關(r=0.973，0.988，0.978，均P<0.05)。見表1。

2.3血脂水平 大鼠TC、LDL-C水平隨著大鼠周齡增加而增加(P<0.05)。大鼠血脂TC、LDL-C水平和大鼠周齡呈正相關(r=0.992，0.994,均P<0.05)，見表1。

表1 不同周齡大鼠主動脈厚度與信號通路檢測及炎癥因子的檢測結果

3 討 論

年齡和多種疾病相關，年齡的增長可以在多個維度影響動脈粥樣硬化的發生和發展。研究表明，隨著年齡的增加，肥胖率降低而高血壓患病率增加〔8〕。本研究結果表明，大鼠動脈粥樣硬化程度與年齡相關。PARP和動脈粥樣硬化、冠心病等病理過程中細胞程序性死亡有關〔9〕，并調節著多種炎癥因子〔10〕的表達。而通過調控NF-κB來調節炎癥反應是TLR-4調節炎癥反應的主要機制之一。通過MyD88依賴和MyD88非依賴兩條途徑，TLR-4調節細胞內外信號傳導，從而調控細胞內NF-κB的活性，介導下游IL-6等炎癥因子的水平。

綜上，大鼠年齡增長和動脈粥樣硬化的NF-κB炎癥信號通路之間具有緊密的相關性。