膽堿能過活化狀態(tài)下“疏肝調(diào)神”針法對CUMS抑郁大鼠行為學的影響

高靜 賴名殷 梅氏清心 傅文 王孟雨 寧百樂,4 符文彬,4,5,6

(1河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院；3海南醫(yī)學院中醫(yī)學院；4廣東省中醫(yī)院大針灸科；5深圳寶安區(qū)針灸臨床研究中心；6深圳市政府“醫(yī)療衛(wèi)生三名工程”廣東省中醫(yī)院符文彬教授針灸學團隊)

抑郁障礙是一種以快感缺失、持續(xù)而持久的心境低落為主要特征的常見的高患病率、高復發(fā)率的精神心理疾病〔1〕，影響著全球約17%的人口〔2〕。藥物是目前抗抑郁治療的主要手段，但起效慢、副作用大，且服用一線抗抑郁藥的患者中僅約30%可解除癥狀等缺點〔3〕，大大降低了患者的依從性，增加了自殺和死亡的風險。針灸作為一種傳統(tǒng)中醫(yī)療法早已應(yīng)用于抑郁障礙的臨床治療實踐中，以“百會、印堂、合谷、太沖”為主穴的“疏肝調(diào)神”法可有效改善抑郁癥狀，還能緩解抑郁相關(guān)失眠、胃腸功能紊亂、慢性疼痛等癥狀〔4,5〕，但是其作用機制尚未完全闡明。近年來研究證實，中樞膽堿能系統(tǒng)參與情緒調(diào)節(jié)過程〔6,7〕，其中乙酰膽堿(ACh)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與了抑郁障礙的發(fā)生發(fā)展過程〔8〕。膽堿能系統(tǒng)過度活化被認為是抑郁障礙發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔6〕，而抑制過度活化的膽堿能系統(tǒng)可能是抗抑郁的重要靶點〔9～11〕。本研究以膽堿能為切入點，觀察在膽堿能過活化狀態(tài)下，“疏肝調(diào)神”針法電針對慢性不可預知溫和應(yīng)激(CUMS)抑郁模型大鼠前額葉和血清膽堿能相關(guān)因子膽堿酯酶(AChE)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)，乙酰膽堿(ACh)及去甲腎上腺素(NE)和皮質(zhì)醇(CORT)水平和行為學的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康SPF級雄性成年SD大鼠60只，體重180～220 g。動物由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：〔SYXK(粵)2018-0092〕。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗中心SPF級動物實驗室，室溫20～25℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h晝夜明暗交替。本實驗通過廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗中心動物倫理委員會的批準(No.TCMF1-2018027)。

1.2儀器與試劑 木制曠場箱(80 cm×80 cm×40 cm，自制)；亞克力透明水桶(直徑30 cm、高60 cm，自制)；AE-200型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；3K-30 低溫高速離心機(美國Sigma 公司)；Thermo Multiskan FC酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；華佗牌一次性不銹鋼針灸針(0.16 mm ×7 mm，蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司)；Hans-LH202H電針儀(南京濟生醫(yī)學科技有限公司)；蔗糖分析純(廣州化學試劑廠)；東莨菪堿(CAS：51-34-3，北京百靈威科技有限公司，批號：177490)；毒扁豆堿(CAS：64-47-1，英國TOCRIS Bioscience公司，批號：10A/222637)；大鼠Ach ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml003048)；AChE酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國USBiological 公司，貨號：023077)；ChAT ELISA試劑盒(美國USBiological 公司，貨號：382349);NE ELISA試劑盒(臺灣ABnova生物科技公司，KA3836)；CORT ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml002874)。

1.3實驗分組 將SD雄性大鼠按照體重因素分層隨機法進行分組，分別為正常組、模型組，其中正常組不予任何處理，模型組采用CUMS建立抑郁大鼠模型，21 d后根據(jù)糖水偏好實驗篩選出造模成功的大鼠，并根據(jù)糖水偏好率分層隨機分為模型組、電針組、東莨菪堿組(陽性對照)、毒扁豆堿組(膽堿酯酶抑制劑)、電針+毒扁豆堿組，共6組，每組10只。

1.4CUMS造模方法 采用CUMS方法構(gòu)建抑郁動物模型。根據(jù)既往研究及前期實驗基礎(chǔ)，總結(jié)出10種不同的刺激方法：禁食24 h、禁水24 h、潮濕墊料24 h、晝夜顛倒、冰水游泳(4℃，5 min)、行為限制4 h、45°傾籠24 h、夾尾2 min、85 dB噪音3 h、整夜LED頻閃。刺激遵循隨機原則，每日2種，連續(xù)2 d內(nèi)不出現(xiàn)相同應(yīng)激，持續(xù)42 d。

1.5電針干預及給藥方法 于CUMS造模第22天開始電針或藥物干預，持續(xù)3 w。針刺取穴采用符文彬〔4〕的“疏肝調(diào)神”法，包括百會、印堂、合谷、太沖。參考中國針灸學會實驗針灸分會制定的《實驗針灸穴位圖譜》及《實驗針灸學》大鼠穴位圖譜進行定位取穴〔12〕。針刺時，動物保持清醒狀態(tài)，以15°平刺百會、印堂，45°斜刺合谷、太沖，后將動物放置在懸掛式大鼠電針固定裝置(國家實用新型專利，專利號：ZL 2019 2 1340810.6)固定，并將電針儀正負極分別接在合谷和太沖針柄上，調(diào)節(jié)參數(shù)為2/100 Hz,1～1.2 mA，以動物肢體微微顫動為度，百會、印堂針刺后留針不予加電，每日20 min。東莨菪堿組大鼠腹腔注射東莨菪堿(25 μg/kg)，每16 h 1次〔10〕；毒扁豆堿組大鼠腹腔注射毒扁豆堿(0.5 mg/kg)〔13〕，每日1次。電針+毒扁豆堿組大鼠先藥物干預后再進行電針治療，干預方法同電針組和毒扁豆堿組。每組大鼠針刺或藥物干預時間固定在每日上午8∶00～12∶00進行。

1.6體重及行為學方法

1.6.1體重 于CUMS造模的第0天、21天、42天進行稱重。

1.6.2糖水偏好實驗 于CUMS造模的第21天、42天進行糖水偏好實驗。為避免新奇恐懼先進行適應(yīng)性訓練，第1個24 h每籠放置兩瓶1%蔗糖溶液，第2個24 h，每籠放置一瓶裝普通飲用水，另一瓶裝1%蔗糖溶液。24 h飲水剝奪后進行正式實驗：每籠放置兩個外觀、容量相同且密封良好的水瓶，位置隨機，分別裝有普通飲用水和1%蔗糖溶液，每籠1只大鼠。記錄1 h內(nèi)每個瓶子液體消耗量(液體消耗量=起始重量-剩余重量)。計算各大鼠的糖水偏好率(%)=〔1% 蔗糖水消耗量/(1% 蔗糖溶液消耗量+普通飲用水消耗量)〕×100%。糖水偏好率的降低代表了大鼠的抑郁的核心癥狀快感缺失。

1.6.3強迫游泳實驗 于CUMS造模的第42天進行強迫游泳實驗。實驗前，將大鼠于亞力克透明水桶內(nèi)適應(yīng)性游泳15 min(水深30 cm，水溫25±1℃)。24 h后，進行正式實驗。將大鼠放進相同的水桶內(nèi)游泳6 min，并記錄后4 min內(nèi)的累計不動時間，即大鼠漂浮在水面不動或四肢輕微劃動狀態(tài)的累計時間，代表了大鼠的行為絕望狀態(tài)。

1.6.4新環(huán)境抑制進食實驗 于CUMS造模的第42天進行新環(huán)境抑制進食實驗。實驗前對大鼠進行24 h食物剝奪。實驗時，預先在曠場箱中央放置一小塊食物，將大鼠從曠場箱的一角放入，記錄大鼠從進入曠場時到其抱起食物并進食的持續(xù)時間，即延遲進食時間，若期間未進食的則計為6 min。延遲進食時間代表了大鼠的活動能力及對新環(huán)境的興趣力。

1.7取材 行為學測試結(jié)束后，各組取6只大鼠，將大鼠用100 g/ml水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，打開大鼠的胸腹腔，腹主動脈取穴后，以0.9%的氯化鈉溶液心臟灌注(以肺、肝臟、眼睛等組織變白為止)，迅速開顱取腦，分離出前額葉，稱重后放入相應(yīng)編號的凍存管，于-80℃冰箱備用。

1.8ELISA檢測前額葉中AChE、ChAT、ACh、NE和血清中CORT的含量 取血清和前額葉組織，嚴格按照試劑盒操作步驟，檢測AChE、ChAT、ACh、NE、CORT的含量。將標準品和處理后的樣本50 μl依次加入微孔板，每孔再加入酶結(jié)合物，震蕩后37℃孵育，孵育完畢后，棄液并洗滌3次，拍干并用吸水紙微孔壁內(nèi)殘余液體。后依次加入顯色劑A、B，避光常溫孵育20 min后加入終止液。將終止反應(yīng)的微孔板置于酶標儀內(nèi)，使用450 nm波長讀取吸光度值，讀數(shù)在15 min內(nèi)完成。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗，Dunnett test檢驗。

2 結(jié) 果

2.1電針對CUMS抑郁大鼠體重和行為學的影響 CUMS造模第21天，各組間大鼠的體重和糖水偏好率有明顯差異(P<0.05)，與正常組比較，模型組大鼠體重和糖水偏好率均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，其余各組體重和糖水偏好率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CUMS造模第42天(即干預第21天)，各組間大鼠體重、糖水偏好率、強迫游泳累計不動時間和新環(huán)境抑制進食實驗延遲進食時間均有顯著差異(P<0.05)。與正常組比較，模型組體重和糖水偏好率明顯降低，累計不動時間和延遲進食時間顯著延長(P<0.05)；與模型組比較，針刺組與東莨菪堿組大鼠的體重和糖水偏好率顯著增加，累計不動時間和延遲進食時間明顯縮短(P<0.05)，毒扁豆堿組大鼠體重和糖水偏好率顯著減少，累計不動時間和延遲進食時間明顯延長(P<0.05)；與毒扁豆堿組比較，電針+毒扁豆堿組大鼠體重和糖水偏好率明顯增加，累計不動時間和延遲進食時間明顯縮短(P<0.05)。見表1、2。

表1 各組大鼠造模和干預期間體重變化及行為學的比較

2.2各組大鼠前額葉內(nèi)AChE、ChAT、Ach、NE、血清中CORT含量變化的比較 CUMS造模的第42天(干預第21天)，各組間大鼠前額葉AChE、ChAT、ACh、NE、血清中CORT含量有明顯差異(P<0.05)。與正常組比較，模型組大鼠前額葉AChE、NE含量均明顯下降，ChAT、ACh CORT含量明顯升高(均P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠前額葉AChE、NE含量明顯升高，ChAT、ACh、CORT含量顯著下降(均P<0.05)；毒扁豆堿組大鼠前額葉AChE含量降低，ChAT含量升高，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，ACh、血清中CORT含量明顯升高，NE含量明顯下降(P<0.05)；與毒扁豆堿組比較，電針+毒扁豆堿組大鼠前額葉AChE、NE含量升高(P<0.05)，ChAT、Ach、血清中CORT含量降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組間大鼠前額葉中AChE、ChAT、Ach、NE、血清中CORT含量變化的比較

3 討 論

抑郁障礙屬中醫(yī)“郁病”范疇，主因情志過極，五臟氣化失常導致氣機郁滯，癥狀表現(xiàn)為情志不遂、郁郁寡歡；而郁滯日久，由“情郁”深入發(fā)展為“神郁”，進而神明失司，使道不通，神道不利，神機漸泯，出現(xiàn)自殺等嚴重癥狀。因此，“疏肝、理氣、調(diào)神”是治療郁病的關(guān)鍵，“疏肝調(diào)神”針法主穴常選用百會、印堂、合谷、太沖，其中百會、印堂為督脈穴位，“督脈上腦入巔”，又“腦為元神之府，主持五神”，因而百會配印堂可調(diào)神解郁；合谷、太沖二穴名為“四關(guān)”“能大開通也”，又合谷為陽經(jīng)上肢穴位，偏于升發(fā)清氣，太沖為陰經(jīng)下肢穴位，偏于降逆泄?jié)幔ê嫌茫墒箽庋獣尺_，升降有序，上下交濟，陰陽平衡。四穴共奏“疏肝、理氣、調(diào)神”之功。本研究說明“疏肝調(diào)神”針法可有效改善CUMS模型大鼠的抑郁樣行為。

抑郁障礙的發(fā)病機制中，膽堿能過活化致抑郁學說從膽堿能的角度闡釋了抑郁障礙的病理機制〔6〕。早在1973年，Janowsky等〔8〕就提出抑郁障礙是膽堿能優(yōu)勢支配的一種疾病，即抑郁的膽堿能過活化學說。國內(nèi)外研究表明〔13～17〕，抑制ACh的降解，造成突觸間隙的ACh蓄積，或促使受體的過量激活，從而誘導抑郁障礙的發(fā)生〔13～15，18〕；而促進過活化ACh降解，或拮抗膽堿能受體，可發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。應(yīng)激作為抑郁障礙病理過程的重要因素，應(yīng)激反應(yīng)下HPA軸被激活〔19〕，表現(xiàn)為CORT和皮質(zhì)酮等物質(zhì)升高〔20〕。已有研究發(fā)現(xiàn)〔13〕，長期應(yīng)激所致的抑郁狀態(tài)下CORT水平與膽堿能因子ACh變化呈正相關(guān)，表明機體對長期應(yīng)激的調(diào)節(jié)與對膽堿能的超敏性有關(guān)，機體在長期應(yīng)激下表現(xiàn)出的抑郁狀態(tài)與其膽堿能過活化，進而對應(yīng)激的敏感性增加有關(guān)。ACh是由ChAT的催化下由膽堿和乙酰輔酶A合成，隨后以胞吐的方式釋放至突觸間隙，突觸間隙的ACh可由AChE降解，AChE是調(diào)控胞外ACh水平的關(guān)鍵酶〔6〕。既往研究發(fā)現(xiàn)，抑制或者敲除AChE可造成膽堿能系統(tǒng)的過度活化狀態(tài)，從而誘導抑郁癥狀〔14,21〕。本研究中，模型組大鼠表現(xiàn)為體重下降、快感缺失、活動力降低和興趣下降抑郁癥狀，同時還表現(xiàn)為CORT升高和膽堿能過活化狀態(tài)。運用膽堿酯酶抑制劑毒扁豆堿干預后的CUMS大鼠表現(xiàn)為加重抑郁癥狀，其前額葉ACh水平表現(xiàn)亦出升高趨勢。結(jié)合CORT和NE水平升高的結(jié)果，推測膽堿能過活化狀態(tài)下，抑郁大鼠表現(xiàn)出對壓力性應(yīng)激的超敏性，這可能是導致抑郁狀態(tài)的加重原因。ACh的降解過程受阻，AChE降解ACh的過程可能有其他生物途徑參與〔22〕。本研究結(jié)果說明電針可能通過影響ACh的合成或降解過程調(diào)控ACh水平，以解除膽堿能過活化狀態(tài)，從而降低對壓力性應(yīng)激的超敏性，這可能是“疏肝調(diào)神”針法治療抑郁障礙的作用機制。

綜上，“疏肝調(diào)神”針法可有效改善CUMS抑郁大鼠的抑郁樣行為，其作用機制可能參與調(diào)控膽堿能代謝，有效解除膽堿能過活化狀態(tài)，降低機體對應(yīng)激的易感性而發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。最新研究報道，膽堿能受體在抗抑郁效應(yīng)的神經(jīng)生物學機制中發(fā)揮著重要作用〔23,24〕。