老年胃癌患者循環腫瘤細胞與臨床病理特征及化療療效的關系

李欣 趙久達 林明哲 王瓊 魏文娥 包夏青

(青海大學附屬醫院 青海大學附屬腫瘤醫院，青海 西寧 810001)

胃癌是我國最常見的消化系統惡性腫瘤。流行病學研究顯示〔1〕，我國每年胃癌新發病例數為67.9萬，死亡49.8萬例，均處于癌癥發病率和死亡率的第二位。并且我國早期胃癌的發現率較低，大部分患者就診時已處于進展期，需要以化療為主的綜合治療，這在老年人群中體現的尤為明顯。目前評估胃癌化療療效措施較少，大多依靠增強CT等影像學檢查及癌胚抗原等血清腫瘤標記物，靈敏度及時效性均較差，因此有必要探索新的評價體系。循環腫瘤細胞(CTCs)是由腫瘤原發灶或轉移灶脫落至血液循環中的腫瘤細胞，痕量存在于外周血中，能夠反映腫瘤的實時狀態，已被美國食品藥品監督局(FDA)批準用于乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌的預后監測〔2〕。研究顯示〔3〕，CTCs陽性在胃癌患者預后評估方面也具有重要價值。但目前甚少有關于CTCs分型與臨床病理體征及化療療效的研究。鑒于此，本文開展了老年胃癌人群CTCs總數及分型意義的研究。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究經醫院倫理委員會論證通過，患者或家屬簽署知情同意書后實施。選取2019年1月至2020年1月于青海大學附屬醫院腫瘤內科行化療的進展期胃癌患者，依據納入與排除標準，共60例患者納入研究，其中男37例，女23例，年齡60～78歲。依據第8版美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期標準，Ⅲ期38例(ⅢA 14例、ⅢB 16例，ⅢC 8例)，Ⅳ期22例。

1.2納入標準 ①年齡≥60歲；②原發性胃癌，經組織活檢或術后大體病理證實，且病理類型為腺癌；③入組前未接收過任何形式的放化療、免疫治療等；④人類表皮生長因子受體(Her)2未檢測或不適宜行相關靶向治療；⑤既往無惡性腫瘤病史，當前未合并其他部位原發腫瘤；⑥體力狀況(PS)評分0～2；⑦外周血CTCs檢查陽性。

1.3排除標準 ①臨床資料或病理學資料不完整者；②合并風濕性疾病、自身免疫性疾病，或因其他原因長期口服免疫抑制劑者；③嚴重的心肝腎疾病，不能耐受化療者；④因各種原因無法完成4個周期化療，或未能完整收集到血標本者；⑤精神障礙患者。

1.4研究方法及檢測指標 收集患者的臨床病理學資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、T分期、N分期、M分期、有無脈管侵犯等，患者均于化療前1天采集空腹靜脈血5 ml，檢測CTCs總數及分型，分析臨床病理特征與CTCs總數及分型間的關系。TNM分期參照第8版AJCC分期標準。患者均給予氟尿嘧啶+奧沙利鉑為基礎的化療方案，21 d為1周期，每2個周期評價一次；分別于第2周期化療結束后第20天、第4周期化療結束后第20天(即第3、第5周期開始前1天)采集空腹靜脈血5 ml，檢測CTCs總數及分型；并在第4周期化療結束后第20天時同時行影像學及腫瘤標志物的檢查，依據實體瘤的療效評價標準(RECIST1.1)，評估胃癌的化療療效，療效標準分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病情穩定(SD)和疾病進展(PD)。將PR+SD歸入有效組，PD歸入無效組。分析不同療效間CTCs總數及分型間的差異。

1.5CTCs的鑒定 采用Canpatrol CTC系統進行鑒定：采集空腹靜脈血5 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，加入紅細胞裂解液15 ml與其混合，作用30 min，500 r/min離心5 min，去除上清；含4%甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，固定8 min；將細胞懸液轉移到含8 μm濾膜的過濾管中，0.08 MPa真空泵抽濾，將CTCs過濾到濾膜上；再次應用4%甲醛固定1 h。PBS洗滌濾膜3次后，將濾膜轉移到24孔板中，蛋白酶 K預處理1 h；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，加入CK8、CK18、CK19、上皮細胞黏附分子(Ep CAM)標記的上皮型RNA探針，vimentin 和 twist 標記的間質型生物探針及標記CD45的白細胞探針，孵育3 h；洗脫液洗滌3次，加入預擴增液和擴增探針，孵育30 min；洗脫液洗脫3次，再次與擴增液和探針孵育30 min；然后加入美國分子探針公司開發的系列熒光染料：Alexa Fluor 594(上皮)、Alexa Fluor 488(間質)、Alexa Fluor 750(白細胞)3種熒光標記探針，孵育30 min；0.1×檸檬酸鈉緩沖液(SSC)緩沖液洗脫，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min。最后，應用自動熒光顯微鏡觀察細胞，紅色代表上皮型CTC(E+CTC)，綠色代表間質型CTC(M+CTC)，兩者均表達代表混合型CTC(E+/M+CTC)，僅有白色代表白細胞。將M+CTC及E+/M+CTC統稱為間質轉化型CTC(EMT CTC)。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行隨機樣本t檢驗、單因素方差分析、配對樣本t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1CTCs與臨床病理特征 不同性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、T分期及N分期患者CTCs總數和CTCs分型間的差異均無統計學意義(P>0.05)；存在遠處轉移(M1)及有脈管侵犯患者CTCs總數、M+CTCs、E+/M+CTCs及EMT CTCs均明顯高于無遠處轉移(M0)、無脈管侵犯者(P<0.05)，而E+CTCs的差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 CTCs與臨床病理特征間的關系

2.2CTCs與化療療效 60例患者中CR 0例，PR 19例，SD 12例，PD 29例，有效組和無效組化療前CTCs總數及分型間的差異均無統計學意義(P>0.05)；有效組化療2個周期及4個周期后，CTCs總數、M+CTCs、E+/M+CTCs及EMT CTCs均較治療前明顯降低(P<0.05)，且有效組均低于無效組(P<0.05)；有效組化療4個周期后CTCs總數、E+/M+CTCs較2個周期后降低(P<0.05)；化療前后E+CTCs的差異均未見統計學意義(P>0.05)；無效組化療前后CTCs總數及分型間的差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CTCs與化療療效的關系

3 討 論

研究顯示〔4〕，我國胃癌的整體發病率呈下降趨勢，但發病年齡出現后移趨勢，目前平均發病年齡在60歲以上，且隨著年齡的增長，胃癌的發病率也逐漸升高。加之老年人免疫功能下降，多合并其他系統疾病，對疾病及理化治療的耐受性均下降，因此選擇恰當的治療方案，并及時早期評估療效，對于老年胃癌的治療顯得更為緊要。

上皮間質轉化(EMT)是腫瘤細胞實現遠處轉移的關鍵步驟〔5,6〕。實體瘤內的上皮型腫瘤細胞排列緊密、移動性差，不易出現遠處轉移，當其向間質型轉化后，細胞形態和移動性發生改變，細胞可獲得遷移、侵襲能力，進入血液循環，以游離的單個細胞或成簇的細胞團形式存在，即CTCs，最后到達遠處臟器克隆增殖，發展成為肉眼可見的腫瘤病灶。

CTCs痕量存在于血液循環中，無法準確的定量檢測是限制CTCs研究及應用的重要環節。以往的CellSearch系統過度依賴CTCs表達的Ep CAM等上皮標記物，會出現CTCs總數的不足，并且不能對CTCs進行分型。近年來，依據CTCs體積較大(>8 μm)和不表達CD45兩點特性，發展了CanpatrolTM檢測技術〔7〕。CanPatrolTM檢測時先將血紅細胞裂解去除，再通過特定孔徑的過濾膜去除白細胞，最后利用含上皮與間質型標記物的探針進行熒光原位雜交技術(FISH)雜交，實現CTCs計數和分型鑒定。在本研究中，我們應用CanpatrolTM技術證實老年進展期胃癌患者血液循環中廣泛存在CTCs(最多者達23個/5 ml血)，并對其分型進行了準確分類。

檢測CTCs對于判斷胃癌病情具有重要意義。Hong等〔8〕研究顯示，CT或正電子發射計算機斷層掃描(PET-CT)檢查未發現遠處轉移的惡性腫瘤患者中，約20%患者可檢測到CTCs，提示CTCs更有助于判斷腫瘤的復發或轉移。涉及26項研究、2 566例胃癌患者的meta分析顯示〔9〕，Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者CTCs陽性率較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高。Cheng等〔10〕研究顯示，CTCs與胃癌淋巴結轉移、遠處轉移和ki-67水平相關，而與T分期和分化程度無關。嚴曉偉等〔11〕研究也顯示，術前CTCs總數與胃癌N 分期有關，M+CTCs數量與TNM 分期和 N 分期相關。本研究提示發生了間質轉換的CTCs容易造成脈管侵犯和遠處轉移，與上述研究具有相似之處，也符合腫瘤細胞的EMT及遠處轉移過程。

目前關于胃癌術后化療存在著各個版本的共識意見及指南，但均缺乏及時有效的評估策略，在評估化療方案的敏感性及早期有效性方面存在缺陷，檢測化療后CTCs可能對評估化療方案具有一定作用。Liu等〔12〕檢測了胃癌化療前及化療3個月后的CTC水平，顯示化療后CTCs總數降低患者獲得了CR、PR或SD，而CTCs計數升高者出現了疾病進展，且CTCs總數降低者無進展生存期和總生存期更長。另一項對136例接受化療的進展期胃癌患者的研究顯示〔13〕，治療6 w后不良CTC水平(≥3個CTCs/7.5 ml血)患者的總有效率和疾病控制率明顯低于良好CTC水平組(<3個CTCs/7.5 ml血)(7.7% vs 30.0%、76.9% vs 95.0%)。Li等〔14〕研究發現，化療有效患者CTCs總數及M+CTCs比例下降，而化療后疾病進展者M+CTCs比例升高，但因例數減少，未進行統計分析。本研究提示血液循環中發生了間質轉換的CTCs數目降低預示著化療有效，這與化療抑制了EMT有關，而早期檢測CTCs總數及分型有助于評估化療療效。

不同于以往研究專注于CTCs總數或M+CTCs，本研究將E+/M+CTCs及EMT CTCs納入研究，結果顯示后兩者與CTCs總數和M+CTCs整體趨勢基本一致，但在部分情況下(如化療4 w后)，E+/M+CTCs進一步下降提示化療有效。這提示在將來的研究中，或許可以嘗試將具有間質特性的循環腫瘤細胞作為一個整體進行研究。

綜上所述，CTCs總數、M+CTCs、E+/M+CTCs及EMT CTCs與老年胃癌患者遠處轉移及脈管侵犯有關，且化療有效組患者化療后上述各指標均明顯降低。