支氣管哮喘患兒外周血中miR-138 表達與Th1/ Th2 平衡的關系

廖全輝 王水蓉 黃 龍 蔡 雪 付天明 李科興

1.成都市龍泉驛區婦幼保健院兒科，四川成都 610100；2.成都市龍泉驛區婦幼保健院婦產科，四川成都 610100；3.成都市龍泉驛區婦幼保健院新生兒科，四川成都 610100

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）是由多種細胞和細胞組分參與，以氣道慢性炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病，是兒童期最常見的慢性呼吸系統疾病[1]。當前我國兒童BA 的診治雖然取得較大進展，但仍有30%的患兒未能及時診斷，超過20%的患兒未達到良好控制，因此，BA 防治等相關領域一直是研究熱點[2-3]。研究顯示，T 淋巴細胞在BA 氣道慢性變態反應性炎癥中發揮重要作用，其中輔助性T 細胞（helper T cell，Th）1 和Th2 比例失衡是BA 發生的重要基礎[4]。非編碼RNA 是一類不編碼蛋白質RNA，具有調控免疫穩態、炎癥反應等作用，與BA 發生密切相關[5-9]。微小RNA（microRNA，miR）-138 是新近發現的一種miRNA，已有研究證實其參與過敏性哮喘、骨關節炎等慢性炎癥性疾病的發生發展[10-11]，但關于其在兒童BA 中的作用尚不明確。本研究分析BA 患兒外周血miR-138 表達與Th1/Th2 平衡的關系，以期為BA 防治提供更多依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取成都市龍泉驛區婦幼保健院（以下簡稱“我院”）2020 年1 月至2021 年3 月收治的103 例BA 患兒為研究對象，根據臨床表現分為急性發作期組（42 例）和臨床緩解期組（61 例）。急性發作期組男22 例，女20 例；年齡2～12 歲，平均（7.52±2.54）歲。臨床緩解期組男33 例，女28 例；年齡3～13 歲，平均（7.48±2.57）歲。納入標準：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》[12]中BA 診斷標準；②年齡＜14 歲；③患兒家屬或監護人知情研究并簽署同意書。排除標準：①先天氣道、肺組織發育異常；②合并支氣管擴張、過敏性鼻炎、呼吸衰竭、肺結核、氣道內阻塞性疾病；③近2 周內呼吸道感染史；④近4 周內糖皮質激素使用史；⑤血液系統、免疫系統疾病。另選取我院同期82 名體檢健康兒童為對照組，其中男44 名，女38 名；年齡1～12 歲，平均（7.50±2.63）歲。三組一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miR-138 和Th1、Th2 相關轉錄因子水平測定 采集BA 患兒入院時及對照組體檢時外周血6 ml，乙二胺四乙酸抗凝，取3 ml 外周血，Trizol 總RNA 抽提試劑（北京普利萊基因技術有限公司，貨號：R1030）提取外周血總RNA，TaKaRa 逆轉錄試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，貨號：RR036A）轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR 反應，miR-138 正向引物：5’-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3’，反向引物：5’-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTCTG-3’；T-bet 正向引物：5’-TGTGACCCAGAGATTGTCT-3’，反向引物：5’-TGCGTGTTGGAAGCGTTG-3’；GATA結合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）正向引物：5’-CGGCAGGACGAGAAAGAGT-3’，反向引物：5’-TAGGGCGGGTAGGTGGTGA-3’。反應體系（總體積10.0 μl）：5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，引物各0.3 μl，1.0 μl cDNA，3.4 μl ddH2O；擴增條件：95℃預變性90 s，循環1 次，95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環40 次。以U6 作為內參，正向引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，2-ΔΔCt法計算外周血miR-138、T-bet、GATA3 相對表達量。

1.2.2 外周血Th1、Th2 百分比和相關細胞因子測定取外周血1 ml 抗凝，RPMI-1640 培養基等體積稀釋外周血100 μl，加入10 μl 刺激劑，5%CO2培養箱37℃孵育4 h，加入CD3-PC5 抗體、CD8-PC7 抗體，避光孵育15 min，裂解，破膜，加入白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）-PE 抗體、γ 干擾素（interferon-γ，INF-γ）-FITC抗體，避光孵育20 min，洗滌后賽默飛Attune NxT流式細胞儀檢測外周血Th1、Th2 百分比，并計算Th1/Th2。取2 ml 外周血，3000 r/min 離心10 min（離心半徑為8 cm），取上清，酶聯免疫吸附試驗法測定IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、T-bet 試劑盒購于上海富雨生物科技有限公司（貨號：FY-03183H2、FY-03181H2、FY-03188H2、FY-04313H1、FY-04432H2）；GATA3 試劑盒購于上海信帆生物科技有限公司（貨號：XFH10177）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較SNK-q 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性采用Pearson相關性分析。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組外周血miR-138 表達、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比較

急性發作期組外周血miR-138 表達、Th2 百分比高于臨床緩解期組、對照組，Th1 百分比、Th1/Th2 低于臨床緩解期組、對照組（P ＜0.05）；臨床緩解期組外周血miR-138 表達、Th2 百分比高于對照組，Th1百分比、Th1/Th2 低于對照組（P ＜0.05）。見表1。

表1 三組外周血miR-138 表達、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比較（）

表1 三組外周血miR-138 表達、Th1 百分比、Th2 百分比、Th1/Th2 比較（）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與臨床緩解期組比較，bP ＜0.05。Th：輔助性T 細胞

2.2 三組外周血Th1、Th2 相關轉錄因子水平比較

急性發作期組外周血T-bet 水平低于臨床緩解期組、對照組，GATA3 水平高于臨床緩解期組、對照組（P ＜0.05）；臨床緩解期組外周血T-bet 水平低于對照組，GATA3 水平高于對照組（P ＜0.05）。見表2。

表2 三組外周血Th1、Th2 相關轉錄因子水平比較（）

表2 三組外周血Th1、Th2 相關轉錄因子水平比較（）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與臨床緩解期組比較，bP ＜0.05。Th：輔助性T 細胞

2.3 三組外周血Th1、Th2 相關細胞因子水平比較

急性發作期組外周血IL-2、IFN-γ 水平低于臨床緩解期組、對照組，IL-4、IL-10 水平高于臨床緩解期組、對照組（P ＜0.05）；臨床緩解期組外周血IL-2、IFN-γ水平低于對照組，IL-4、IL-10 水平高于對照組（P ＜0.05）。見表3。

表3 三組外周血Th1、Th2 相關細胞因子水平比較（ng/ml，）

表3 三組外周血Th1、Th2 相關細胞因子水平比較（ng/ml，）

注 與對照組比較，aP ＜0.05；與臨床緩解期組比較，bP ＜0.05。Th：輔助性T 細胞；IL：白細胞介素；IFN-γ：γ 干擾素

2.4 BA 患兒外周血miR-138 表達與T-bet、GATA3和Th1/Th2 及相關細胞因子的相關性

BA 患兒外周血miR-138 表達與T-bet、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ 呈負相關（r=-0.498、-0.515、-0.464、-0.428，P ＜0.01），與GATA3、IL-4、IL-10 呈正相關（r=0.595、0.518、0.386，P ＜0.01）。

3 討論

BA 是兒童呼吸內科常見病，隨著病情進展可發展為氣道重塑，引起氣道增厚狹窄，甚至阻塞性通氣功能障礙，威脅患兒生命安全，積極探索其發病機制對早期診斷和提升治療效果意義重大。BA 發病機制可概括為氣道炎癥-免疫、遺傳、神經調節，其中氣道炎癥-免疫機制是由多種細胞因子、炎癥介質、炎癥細胞共同參與和相互作用的結果[13]。Th 是調控免疫和炎癥的關鍵細胞，Th1、Th2 均來源于Th 亞群，研究顯示，Th1/Th2 失衡在BA 發生發展中扮演重要角色[4]，但關于Th1/Th2 平衡與BA 發病相關靶基因的生物標志物研究較少。

miRNA 是一類長度為20～24 個核苷酸的非編碼RNA，具備轉錄后水平調節基因表達功能，可通過調控免疫和炎癥反應，參與BA 的發生發展[14]。miR-138位于人染色體3p21.32，既往研究多報道其在多種實體腫瘤中的作用[15-16]。Wei 等[17]研究顯示，miR-138 能結合細胞毒性T 淋巴細胞相關分子4、細胞程序性死亡受體1 的3’-非翻譯區參與相關免疫反應過程。Shao 等[18]研究顯示，miR-138 能通過調節組蛋白去乙酰化酶激活核因子-κB 信號通路，促進類風濕關節炎的炎癥進展。本研究結果顯示，BA 患兒外周血miR-138 表達明顯高于對照組，提示miR-138 參與BA發生。急性發作期是指BA 突然發生或原有BA 癥狀加重，本研究結果顯示，急性發作期患兒外周血miR-138表達明顯高于臨床緩解期患兒，提示miR-138 可能參與BA 發生發展。

Th 因具有抑制T 淋巴細胞免疫應答功能，在BA發病機制中處于核心位置[4]。前體Th0 細胞可分化為Th1 與Th2，其中Th1 能分泌IL-2、IL-12、IFN-γ、腫瘤壞死因子-β 等細胞，參與細胞免疫；Th2 能分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13 等細胞，參與體液免疫[19]。Th1 分泌的IFN-γ 能抑制Th2 功能和分化，Th2 分泌的IL-4 能抑制Th1 功能和分化。因此，生理狀態下Th1 和Th2 的功能和細胞數量是穩定的，以確保兩者平衡，若Th1/Th2 失衡，則會抑制T 淋巴細胞免疫應答，觸發炎癥反應[20-22]。本研究結果顯示，BA 患兒外周血Th1 百分比、Th1/Th2 明顯低于對照組，Th2 百分比明顯高于對照組，這種差異在急性發作期患兒和臨床緩解期患兒中仍然存在，提示BA 患兒的Th1/Th2 平衡明顯失調，向Th2 方向偏移。同時本研究結果顯示，急性發作期組外周血Th1 相關抗炎細胞因子（IL-2、IFN-γ）水平明顯低于臨床緩解期組、對照組，Th2 相關促炎細胞因子（IL-4、IL-10）水平明顯高于臨床緩解期組、對照組，提示Th1/Th2 失衡可能導致了炎癥反應的發生，符合既往研究報道[4]。強直性關節炎患者外周血miR-138 與Th1/Th2 呈負相關[23]。本研究結果顯示，BA 患兒外周血miR-138 與Th1/Th2 呈負相關，提示miR-138 可能通過調節Th1/Th2 平衡介導BA 炎癥反應進展。BA 患兒外周血miR-138 與IL-2、IFN-γ 呈負相關，與IL-4、IL-10 呈正相關，進一步證實miR-138 通過調節Th1/Th2 平衡介導BA 炎癥反應進展。T-bet 與GATA3 是一種轉錄因子，能選擇性表達于Th1 與Th2，決定Th0 的分化方向[24-25]。本研究結果顯示，急性發作期組外周血T-bet 水平明顯低于臨床緩解期組、對照組，GATA3 水平明顯高于臨床緩解期組、對照組；臨床緩解期組外周血T-bet 水平明顯低于對照組，GATA3 水平高于對照組。符合本研究中BA 患兒Th1、Th2 變化趨勢。本研究結果顯示，BA 患兒外周血miR-138 與T-bet 水平呈負相關，與GATA3水平呈正相關，提示miR-138 可能通過調控T-bet、GATA3 影響Th1/Th2 平衡。

綜上所述，BA 患兒外周血miR-138 表達顯著上調，可能通過調節Th1/Th2 平衡介導炎癥反應，參與BA 發生發展。但本研究樣本量較少，同時關于miR-138 與Th1/Th2 的具體調控機制還需體外細胞研究驗證。