苦金片對Poly（I∶C）刺激巨噬細胞病毒感染的影響

朱春雪 何嫣婕 何美娟 劉 晴 劉承雨 王一成 黃漢鵬

江蘇大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，江蘇鎮江 212000

病毒感染細胞后，Toll 樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）特異性識別病毒雙鏈核糖核酸，激發炎癥因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等轉錄，出現炎癥級聯反應[1-3]；誘發內質網應激反應，導致相關基因如肌醇需求酶-1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）、拼接型X 盒子結合蛋白1（spliced X-box binding protein 1，xBP1s）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）等增加，引起或加重炎癥、細胞自噬及凋亡[4-8]。

中藥苦金片清熱利咽、消腫止痛，但抗病毒作用鮮見報道。本研究采用病毒類似物Poly（I∶C）感染巨噬細胞體外模擬活病毒感染[9-10]，觀察苦金片對感染過程中炎癥因子、內質網應激反應相關基因及抗病毒因子如干擾素調節因子-3（interferon regulatory factor-3，IRF-3）、β 干擾素（interferon-β，IFN-β）、干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）、寡腺苷酸合成酶1（oligoadenylate synthetase 1，OAS1）、黏病毒耐藥蛋白1（myxovirus resistance 1，MX1）的影響。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）（上海酶研科技有限公司）；Poly（I∶C）（APExBIO 公司，貨號：B5551313 377BD）；高糖DMEM 培養基、胎牛血清（Gibco 公司，貨號：8120281、42F335）；RNA 逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，批號：AJG2280A、AI80465A）；BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，生產批號：No.090120201103）；GAPDH、caspase-3、IL-6、TNF-α、TGF-β、xBP1s 兔抗鼠多克隆抗體（CST公司，貨號：#9662、#2118、#12912、#11948、#3711、#40435）；CCK-8 試劑盒（東仁化學研究所，批號：FH783）；苦金片（上海醫藥集團青島國風藥業股份有限公司，批號：151003）。

1.2 研究方法

1.2.1 溶液制備 苦金片溶液：適量苦金片置磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered solution，PBS），59℃水浴5 h，室溫下，以離心半徑20 cm，3500 r/min 離心10 min，過濾，配成100 mg/ml 溶液，4℃保存。

Poly（I∶C）溶液：適量Poly（I∶C）溶于PBS 制成10 mg/ml 溶液，-20℃保存。

1.2.2 細胞培養 RAW264.7 細胞培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM 中，37℃、5%CO2孵箱（Thermo 公司，150i 型）培養。

1.2.3 CCK-8 法檢測RAW264.7 細胞活力 RAW264.7細胞按104個細胞/孔密度接種于96 孔板。為觀察濃度對細胞的影響，設立苦金片不同濃度組（1、2、5 mg/ml）、空白組、對照組（加入等量培養基）、Poly（I∶C）（20 μg/ml）組，實驗重復5 次，每100 μl 培養基加10 μl CCK-8孵育2 h，酶標儀（Thermo 公司，fc 型）檢測450 nm 光密度（optical density，OD）值，細胞活性（%）=（給藥組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

1.2.4 細胞分組 RAW264.7 細胞接種于6 孔板并分為三組：對照組、Poly（I∶C）組與苦金片組（1 mg/ml），實驗重復5 次。Poly（I∶C）組予Poly（I∶C）（20 μg/mL）刺激12 h，苦金片組在Poly（I∶C）刺激后，吸去上清，洗滌后予苦金片（1 mg/ml）刺激6 h，對照組不予特殊處理。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應 Trizol 試劑提取對照組、Poly（I∶C）組、苦金片組（1 mg/ml）細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，PCR 反應條件：預變性95℃，30 s，1 個循環；95℃，5 s，40 個循環。引物序列（上海生工生物科技有限公司）見表1。將值標準化為Tublin 表達，結果用2-ΔΔCt表示。

表1 引物序列

1.2.6 蛋白質免疫印跡法 對照組、Poly（I∶C）組、苦金片組（1 mg/ml）細胞充分裂解后離心，收集總蛋白，加熱變性后取20 μg 蛋白上樣，凝膠電泳（80 V 30 min，110 V 1 h）后濕轉到PVDF 膜（300 mA，2 h），室溫封閉1.5 h，分別用GAPDH 抗體、IL-6 抗體、TNF-α 抗體、caspase-3 抗體、xBP1s 抗體1∶1000 稀釋后4℃搖床孵育過夜（GAPDH 為內參）。清洗后與HRP 標記羊抗兔二抗（1∶100）室溫孵育1.5 h，清洗曝光，Image J軟件分析灰度。

1.3 統計學方法

采用Graphpad Prism 對結果作圖并進行統計學分析，計量數據以均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 苦金片對Poly（I∶C）刺激下巨噬細胞活力的影響

Poly（I∶C）組細胞活力低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；苦金片不同濃度組高于Poly（I∶C）組，差異統計學意義（P ＜0.05）。苦金片不同濃度組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），后續實驗中苦金片濃度選擇1 mg/ml。見圖1。

圖1 苦金片對Poly（I∶C）刺激下巨噬細胞活力的影響（n=5）

2.2 苦金片對Poly（I∶C）刺激下相關因子mRNA 表達的影響

Poly（I∶C）組TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、MX1，IL-6、TNF-α、TGF-β，IRE1α，xBP1s，CHOP mRNA表達高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P <0.01）；與Poly（I∶C）組比較，苦金片組TLR3、IRF3、IFNβ、ISG15、OAS1、MX1 mRNA 表達上調，IL-6、TNF-α、TGF-β、IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表達下調，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P <0.01）。見圖2。

圖2 苦金片對Poly（I∶C）刺激下相關因子mRNA 表達的影響（n=5）

2.3 苦金片對Poly（I∶C）刺激下相關因子蛋白表達影響

Poly（I∶C）組IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表達高于對照組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；苦金片組IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表達低于Poly（I∶C）組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 苦金片對Poly（I∶C）刺激下相關因子蛋白表達的影響（n=5）

3 討論

呼吸道病毒可引起病毒性呼吸道疾病，臨床發病率高[11-12]，探索有效的治療臨床意義重大。中藥作為我國傳統治療藥物，其中也存在多種抗病毒藥物[13-16]。苦金片由苦地丁、金銀花、黃芩、牛蒡子、桔梗、玄參、甘草組成，其中苦地丁生物堿可抗炎[17]；金銀花中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸-A 等可拮抗流感病毒[18-19]；黃芩苷[20]、牛蒡子苷、牛蒡子苷元[21]等均有抗病毒功效。因此，筆者以Poly（I∶C）體外刺激巨噬細胞模擬病毒感染過程，探索苦金片的抗病毒作用。

TLR3 與配體結合活化會進一步激活IRF3、IFN-β等表達，誘導天然抗病毒反應[22-23]。本實驗顯示，經Poly（I∶C）孵育的巨噬細胞TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、Mx1 mRNA 表達升高，表明Poly（I∶C）可誘導巨噬細胞的抗病毒反應；苦金片組TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、Mx1 mRNA 高于Poly（I∶C）組，提示藥物增強了細胞的抗病毒反應。

另一方面，病毒感染后建立的天然抗病毒信號也能誘導促炎性細胞因子表達，炎癥因子釋放過多會加速細胞溶解或凋亡[24]。本實驗也發現與對照組比較，Poly（I∶C）處理后IL-6、TNF-α、TGF-β、caspase-3 表達增加，表明Poly（I∶C）誘導了嚴重的炎癥反應，加速了巨噬細胞凋亡，苦金片組IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表達低于Poly（I∶C）組，提示苦金片可在一定程度逆轉上述作用。

病毒感染后，大量病毒蛋白在內質網合成中使內質網處于應激狀態，一旦超過內質網負荷能力，細胞凋亡信號通路便被激活[25]。實驗發現，與對照組比較，Poly（I∶C）處理后內質網應激相關基因IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表達升高，與Poly（I∶C）組比較，苦金片組IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表達下調，提示內質網應激被過度激活，苦金片可明顯減輕了這種應激狀態。

綜上，苦金片通過上調抗病毒基因表達、抑制炎癥介質釋放和內質網的過度應激，減少細胞凋亡，提高細胞存活率，提示苦金片具有抗病毒療效，為其臨床應用提供新的依據。