GATA-6、Dkk-1及bFGF在垂體腺瘤中的表達及與預后的相關性

劉 盛，張維波，向 斌，熊江波

垂體腺瘤是常見的中樞神經系統腫瘤，發病率僅次于神經表皮性腫瘤和腦膜瘤[1-2]。病理診斷一直是垂體腺瘤診斷金標準，而隨著對腫瘤發生機制研究的不斷深入，癌基因、抑癌基因等與垂體腺瘤患者病情發展及預后的相關性頗受關注[3]。GATA結合蛋白-6(GATA-6)是GATA家族成員之一，Dickkopf相關蛋白-1(Dkk-1)是近年來發現的Wnt信號通路的抑制分子，隨著二者在腫瘤發展中的作用得到驗證，現已成為腫瘤分子生物學研究的熱點[4-5]。堿性成纖維生長因子(bFGF)在腫瘤發生中起重要作用[6]。雖然目前已在多種腫瘤中檢測到GATA-6、Dkk-1及bFGF的異常表達，但有關三者與垂體腺瘤的相關性研究較少。故本研究分析GATA-6、Dkk-1及bFGF在垂體腺瘤患者中的表達情況，并探究三者與患者預后的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月—2018年3月本院收治的經手術治療的垂體腺瘤103例。納入標準：①病理診斷確診垂體腺瘤[7]；②未合并其他部位及組織器官的原發性或繼發性良惡性腫瘤；③首次發病；④所有對象對本研究知情同意。排除標準：①合并血液系統、自身免疫性疾病者；②拒絕接受病理檢查者；③切取病理組織前4周接受化學、放射、靶向及免疫調節治療者；④合并嚴重系統疾病及臟器功能不全者；⑤合并精神疾病或意識障礙者。103例中男58例，女45例；年齡45～80(64.19±3.15)歲；臨床表現：頭痛89例，閉經泌乳綜合征43例，尿崩癥39例，指端肥大癥21例；術前均行CT和MRI檢查；垂體微腺瘤45例，垂體大腺瘤39例，垂體巨大腺瘤19例；侵襲性垂體腺瘤54例；垂體泌乳素腺瘤30例，生長激素腺瘤26例，促腎上腺皮質激素腺瘤23例，非功能性腺瘤24例；行經鼻蝶手術35例，經額/眉弓入路腫瘤切除術30例，聯合入路腫瘤切除術28例，分期手術10例。收集所有患者手術瘤組織及少量瘤旁正常組織。本研究已通過本院醫學倫理委員會批準同意。

1.2研究方法

1.2.1GATA-6、Dkk-1及bFGF檢測：手術切除標本脫蠟、水化處理后，0.3%過氧化氫溶液孵育10 min，枸櫞酸鹽緩沖液浸泡，5及6 ℃微波處理2次，修復抗原；自來水沖洗5 min，磷酸鹽緩沖液洗2 min，共3次；山羊血清封閉后棄封閉液，不洗，陰性對照片加PBS液。實驗片加適量一抗4 ℃保濕、過夜，PBS液洗5 min共3次，滴加二抗，室溫孵育30 min。PBS液洗2 min共3次，然后DAB顯色，自來水沖洗后，復染、脫水、透明、封片。

1.2.2結果判定：隨機選取高倍視野下10張圖片，根據染色深淺和視野中陽性細胞比例評分：0分為無著色；1分為淺黃色，陽性細胞比例<25%；2分為棕黃色，陽性細胞比例25%～50%；3分為棕褐色，陽性細胞比例≥50%。免疫反應評分為二者評分相乘：陰性為0～1分，弱陽性為2～4分，中等陽性為5～8分，強陽性為9～12分，其中將弱陽性、中等陽性及強陽性定義為陽性[8-9]。

1.3隨訪方法 隨訪時間截至2020年3月，隨訪方式主要為來院復查。總生存時間為垂體腺瘤患者從手術至死亡的時間[10]。

1.4觀察指標 觀察比較103例垂體腺瘤瘤組織及瘤旁正常組織GATA-6、Dkk-1及bFGF表達情況；記錄103例預后情況，比較不同預后患者相關資料差異，分析GATA-6、Dkk-1及bFGF表達與患者預后的相關性。

1.5統計學方法 應用SPSS 22.0軟件分析數據。計數資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗；垂體腺瘤患者預后的影響因素采用多因素Logistic回歸分析。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1GATA-6、Dkk-1及bFGF陽性表達率比較 103例瘤組織GATA-6及bFGF陽性表達率高于瘤旁正常組織，Dkk-1陽性表達率低于瘤旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 垂體腺瘤103例瘤組織和瘤旁正常組織GATA-6、Dkk-1及bFGF表達情況比較[例(%)]

2.2影響垂體腺瘤患者預后的單因素分析 根據隨訪資料，103例生存75例(生存組)，死亡28例(死亡組)，生存率為72.82%。分析103例臨床資料顯示，瘤卒中、侵犯海綿竇、侵襲性腫瘤及GATA-6、Dkk-1、bFGF表達2組間比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，年齡、性別、腫瘤直徑、囊變、壓迫視神經情況2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 影響垂體腺瘤103例預后的單因素分析(例)

2.3影響垂體腺瘤患者預后的多因素Logistic回歸分析 將“2.2”項下有統計學意義的因素納入多因素Logistic回歸分析并賦值(表3)，經多因素Logistic回歸分析顯示，瘤卒中及GATA-6陽性、Dkk-1陰性、bFGF陽性表達是垂體腺瘤患者預后的獨立危險因素(P<0.01)，見表4。

表3 影響垂體腺瘤患者預后多因素Logistic回歸分析賦值表

表4 影響垂體腺瘤患者預后的多因素Logistic回歸分析

3 討論

隨著影像學技術的不斷發展，垂體腺瘤檢出率逐漸升高，現已成為威脅人類健康的重要腫瘤性疾病[11]。近年來，分子標志物在預測垂體腺瘤患者預后中的作用逐漸引起了學者們的廣泛關注。

抑癌基因Dkk-1屬于Dickkopfs家族，擁有255～350個氨基酸殘基，同時含有2個富含半胱氨酸的保守區域[12]。研究表示，Dkk-1對于Wnt信號通路傳導有終止作用，在一定程度上控制此通路下游腫瘤增殖因子、轉移抑制因子、凋亡控制基因、細胞周期蛋白表達[13-14]。陸志斌等[15]采用改良雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測正常人群及食管癌患者(Ⅰ+Ⅱ期)外周血Dkk-1含量，結果顯示食管癌患者外周血Dkk-1含量異于正常人群，且食管癌患者外周血Dkk-1含量與腫瘤分期明顯相關，認為外周血Dkk-1檢測有利于Ⅰ～Ⅱ期食管癌的診斷與治療。本研究結果進一步證實了Dkk-1作為抑癌基因可通過抑制瘤細胞生長與誘導瘤細胞凋亡在垂體腺瘤發生與進展中起關鍵作用。

人類GATA-6基因位于染色體18q11.1～q11.2，可調控595個氨基酸。此基因主要在來源于中胚層和內胚層的各種組織中表達，可在胚胎期心、肺發育過程中通過調節Wnt信號通路發揮作用。有研究發現，GATA-6通過抑制15-脂氧合酶-1的表達調節結直腸癌細胞的增殖，且其異常表達與卵巢癌的分化關系密切[16-17]。因此推測GATA-6可通過Wnt信號通路在腫瘤發生、發展中起一定作用。本研究采用免疫組織化學染色法檢測垂體腺瘤組織中GATA-6的表達情況，并分析其與患者預后的相關性，結果顯示GATA-6在垂體腺瘤瘤組織中的陽性表達率高于瘤旁正常組織，表明GATA-6可作為癌基因誘導垂體腺瘤組織生長。

血管生成與垂體腺瘤的發生、發展關系密切，因此作為腫瘤血管形成因子的bFGF或許可能作為評估惡性腫瘤進展的有效指標[18]。既往文獻報道，bFGF可促進表皮及內皮細胞再生，加速二者分裂，誘導其脫離基膜，刺激內皮細胞向腫瘤組織趨化并形成管狀結構[19]；同時也可促進垂體腺瘤轉化基因表達，刺激細胞增殖和分化[20]；可提高組織中血纖維蛋白溶解酶原激活因子活性，并誘導內皮細胞產生蛋白酶，導致新血管生成。本研究結果提示，GATA-6陽性、Dkk-1陰性及bFGF陽性表達是垂體腺瘤患者預后的獨立危險因素，提示GATA-6、Dkk-1及bFGF表達在垂體腺瘤發生、發展中具有協同作用，對垂體腺瘤生物學行為的評估具有十分重要的意義。

此外，本研究還發現瘤卒中亦是垂體腺瘤患者預后的獨立危險因素。垂體腺瘤卒中是指垂體腺瘤在生長過程中突發瘤內出血或梗死所引起的一組綜合征，臨床上表現為在原有垂體腺瘤癥狀基礎上，出現突發頭痛、視力下降、眼肌麻痹和意識改變等癥狀，嚴重者可迅速昏迷甚至死亡。因此為提高垂體腺瘤患者生存率，預防瘤卒中有重要意義。

綜上，GATA-6、bFGF在垂體腺瘤中高表達，Dkk-1在垂體腺瘤中低表達，GATA-6、Dkk-1及bFGF的異常表達是垂體腺瘤患者預后的獨立危險因素，臨床可對高危人群采取相應干預手段，以延長患者生存期。