青藤堿治療氣陰兩虛型類風濕關節(jié)炎的效果及對MyD88依賴性信號通路的影響

湯文通，洪盛威，孫廣瀚，汪 悅

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是臨床常見的自身免疫性疾病，多發(fā)于中老年人群，主要表現(xiàn)為慢性關節(jié)滑膜炎癥，隨著疾病進展，可發(fā)生骨侵蝕、關節(jié)破壞，并引發(fā)骨質(zhì)疏松等，最終導致進行性、多變性關節(jié)功能障礙[1]。臨床以手術、藥物治療為主，可一定程度控制疾病進展，改善關節(jié)功能，但病情易反復，治愈難度較大[2]。目前，尚無根治RA的方法，主要以藥物緩解關節(jié)炎癥狀態(tài)和延緩病情進展，但部分患者對治療藥物的敏感性不高[3]。近年來，中西醫(yī)結(jié)合治療RA已成為趨勢且取得了初步成效。青藤堿是中藥青風藤中特有的生物堿成分，具有免疫抑制、抗炎等藥理作用，現(xiàn)已用于RA治療，但其治療機制尚未完全揭示[4]。髓樣分化因子88(MyD88)依賴性信號通路是參與機體固有免疫和炎癥反應的一種重要信號通路，具有調(diào)控炎性因子生成和釋放的作用，而炎癥反應作為RA的重要病理改變，提示該信號通路可能參與RA的發(fā)生發(fā)展[5]。中醫(yī)認為RA屬于“尪痹”范疇，且臨床常用的糖皮質(zhì)激素有“壯火”之效，久用必導致患者火旺耗氣傷陰，故大多患者常出現(xiàn)虛煩多夢、自汗盜汗、乏力氣短、手足心熱等氣陰兩虛證表現(xiàn)[6]。本研究觀察青藤堿治療氣陰兩虛型RA的臨床效果，并對其作用機制以及與MyD88依賴性信號通路之間的關系進行探討，以期為臨床應用提供參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4—12月南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院收治的88例氣陰兩虛型RA為研究對象。①納入標準：均符合美國風濕病學會2009年修訂的RA診斷標準[7]；均符合《類風濕關節(jié)炎病證結(jié)合診療指南》中氣陰兩虛型RA的診斷標準[8]，主癥為關節(jié)腫大、肌肉酸痛、氣短乏力及口干眼澀；且具備良好理解能力。②排除標準：合并強直性脊柱炎、膝關節(jié)骨性關節(jié)炎及其他自身免疫性疾病；有消化道出血、消化性潰瘍、大便隱血陽性病史；妊娠或哺乳期女性；嚴重心、肝、腎等重要臟器功能障礙；有重度高血壓、嚴重糖尿病、心腦血管疾病等合并癥。根據(jù)治療方法不同將患者分為觀察組和對照組，每組44例。觀察組男22例，女22例；年齡(50.62±4.37)歲；病程(6.04±0.55)年；體質(zhì)量指數(shù)(23.52±2.25)kg/m2。對照組男18例，女26例；年齡(51.12±4.21)歲；病程(5.85±0.63)年；體質(zhì)量指數(shù)(24.05±2.17)kg/m2。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2治療方法 對照組給予雷公藤多苷片(貴州漢方藥業(yè)有限公司，國藥準字Z52020369)1～1.5 mg/(kg·d)餐后口服，3/d，同時給予甲氨蝶呤片(上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字H31020644)10 mg口服，每周1次。觀察組在對照組基礎上聯(lián)合鹽酸青藤堿腸溶片(煙臺魯銀藥業(yè)有限公司，國藥準字H37023717)20 mg口服，3/d。1個月為1個療程，兩組均治療3個療程。

1.3觀察指標及評價標準

1.3.1主要觀察指標：比較兩組治療前及治療3個月后歐洲抗風濕聯(lián)盟干燥綜合征患者報告指數(shù)(ESSPRI)評分、歐洲抗風濕病聯(lián)盟干燥綜合征疾病活動指數(shù)(ESSDAI)評分。治療前及治療3個月后于清晨采集患者空腹靜脈血4 ml，靜置1 h，離心取血清保存于-80 ℃冰箱待測，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IgG水平。

1.3.2疼痛及臨床癥狀改善情況：比較兩組疼痛視覺模擬量表(VAS)評分[9]及臨床癥狀改善情況，分別于治療前及治療1、2、3個月后采用VAS評分評價疼痛程度，VAS評分越高則疼痛程度越劇烈；分別于治療前及治療3個月后觀察腫脹關節(jié)數(shù)、壓痛關節(jié)數(shù)，以及壓痛、腫脹等癥狀評分，其中壓痛評分分為3分(劇痛)、2分(壓痛)、1分(輕痛)、0分(無痛)，腫脹評分分為2分(重度)、1分(輕度)、0分(無腫脹)。

1.3.3炎性因子：治療前及治療3個月后于清晨采集患者空腹靜脈血4 ml，靜置1 h，離心取血清保存于-80 ℃冰箱待測。使用TECAN15018型酶聯(lián)免疫光譜分析儀(Tecan Schneiz A)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素-17(IL-17)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應蛋白(CRP)水平。

1.3.4MyD88依賴性信號通路相關蛋白mRNA表達：治療前及治療3個月后于清晨采集患者空腹靜脈血4 ml，EDTA抗凝，以淋巴細胞分離液處理獲取外周血單核細胞，用Trizol裂解液裂解細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 ml的EP管中，加入氯仿后震蕩混勻，室溫下靜置3 min，4 ℃條件下12 000×g離心15 min，取出上清液，加入等體積的異丙醇溶液混勻后，4 ℃條件下12 000×g離心10 min，去除上清，加入70%乙醇1 ml，4 ℃條件下12 000×g離心10 min，吸取上清，加入50 μl無RNase水，保存于-70 ℃冰箱待測。取5 μl樣品溶液于Buffer中，在260 nm和280 nm波長處測定吸光度值，計算RNA濃度。以5 μl樣品溶液總RNA為模板，按TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific)說明書的要求將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SimpliAmp PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific)進行擴增，以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測MyD88、Toll樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)mRNA相對表達量(2-ΔΔCt法)，其中ΔCt=Ct目標mRNA-CtGAPDH。MyD88引物序列上游：5'-GAGATCCGCGAGTTTGAGAC-3'，下游：5'-TYGTCTGTGGGACACTGCTC-3'；TLR4引物序列上游：5'-AGGATGATGCCAGGATGATGTC-3'，下游：5'-TCAGGTCCAGGTTCTTGGTTGAG-3'；NF-κB引物序列上游：5'-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3'，下游：5'-CTTCTCTCCCCAGGAATA-3'；GAPDH引物序列上游：5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'；引物由南京金斯瑞科技有限公司合成。

1.3.5不良反應：觀察并比較兩組治療過程中不良反應發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1主要觀察指標比較 治療后，兩組ESSPRI評分、ESSDAI評分、IgG水平均較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 不同方法治療氣陰兩虛型類風濕關節(jié)炎兩組主要觀察指標比較

2.2臨床癥狀改善情況及VAS評分比較 治療后，兩組腫脹關節(jié)數(shù)、壓痛關節(jié)數(shù)、壓痛評分、腫脹評分均較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表2。治療1、2、3個月后，兩組VAS評分較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表3。

表2 不同方法治療氣陰兩虛型類風濕關節(jié)炎兩組臨床癥狀改善情況比較

表3 不同方法治療氣陰兩虛型類風濕關節(jié)炎兩組視覺模擬量表評分比較分)

2.3TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平比較 治療后，兩組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平均較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 不同方法治療氣陰兩虛型類風濕關節(jié)炎兩組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平比較

2.4炎性因子水平比較 治療后，兩組血清IL-6、IL-17、TNF-α、CRP水平較治療前降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 不同方法治療氣陰兩虛型類風濕關節(jié)炎兩組炎性因子水平比較

2.5不良反應比較 觀察組出現(xiàn)呼吸道感染、頭痛、口腔潰瘍各2例，紅斑皮疹、惡心嘔吐各1例；不良反應發(fā)生率為18.18%。對照組出現(xiàn)惡心嘔吐2例，呼吸道感染、頭痛、口腔潰瘍各1例；不良反應發(fā)生率為11.36%。兩組不良反應發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組發(fā)生的不良反應均癥狀較輕，停藥后自行緩解，故未采取治療措施。

3 討論

RA作為一種臨床常見的自身免疫性疾病，具有較高的致殘、致畸率，主要臨床癥狀包括關節(jié)壓痛、腫脹，對患者的生活和工作造成嚴重影響。目前，RA主要應用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及新型生物制劑治療；上述藥物雖有一定療效，但不良反應也較明顯，導致患者難以堅持長期用藥[1]。中醫(yī)辨證治療RA已取得一定效果，特別是對于病程較長的氣陰兩虛型RA，中醫(yī)藥對改善氣陰兩虛癥狀療效明顯，同時對RA證候進行準確分型，待確定證素后進行針對性的合理用藥，可達到較佳的療效。臨床藥理研究證實，青藤堿具有改善機體炎癥反應，降低炎性因子分泌和表達的作用，還具有一定的免疫抑制功效[10]。因此本研究應用青藤堿治療氣陰兩虛型RA，并分析其起效機制。

本研究結(jié)果顯示，治療后，兩組的主要觀察指標、臨床癥狀指標均明顯改善，其中觀察組改善情況明顯優(yōu)于對照組，表明青藤堿可顯著改善氣陰兩虛型RA患者的臨床癥狀，提高治療效果。從中醫(yī)角度分析，RA的病機在于濕、寒、熱、風等邪氣滯留肢體關節(jié)、筋脈、肌肉，引起經(jīng)絡痹阻，其中對于氣陰兩虛型RA的治療在于養(yǎng)陰益氣、通絡止痛[11]。青藤堿是從青風藤中提取的活性成分，青風藤藥性辛、苦、平，具有祛風濕、通經(jīng)絡的功效，對風濕痹痛、關節(jié)腫脹等具有良好的治療作用，且青藤堿相關制劑已被用于RA的治療[12]。另外，現(xiàn)代藥理學認為，青藤堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等藥理活性，如青藤堿可抑制RA患者滑膜成纖維細胞分泌炎性因子，進而抑制炎性因子對趨化因子的誘導，還能抑制細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化，改善關節(jié)炎癥，減輕炎癥反應對關節(jié)組織的損傷并消除腫脹[13]。另外，青藤堿可抑制RA患者樹突狀細胞表達TLRs，進而阻斷TLRs信號通路介導的樹突狀細胞成熟、分化及炎性因子分泌，通過間接抑制T淋巴細胞活化而減輕炎癥反應[14]，從而發(fā)揮治療作用。

MyD88依賴性信號通路與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關，該通路主要通過調(diào)控炎性因子的生成、釋放而影響疾病進展。LIU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制MyD88依賴性信號通路的過度活化可有效促進抑炎因子的生成，抑制促炎因子的分泌，從而減輕RA患者的炎癥反應。本研究結(jié)果顯示，治療后，兩組MyD88依賴性信號通路相關蛋白mRNA表達均明顯降低，且觀察組低于對照組，表明青藤堿可有效抑制MyD88依賴性信號通路，從而減輕關節(jié)炎性損傷，改善RA引起的關節(jié)僵硬、腫脹、疼痛等臨床癥狀，提高治療效果。體外細胞實驗證實，青藤堿可抑制RA成纖維樣滑膜細胞內(nèi)MyD88蛋白及基因的表達，從而延緩成纖維樣滑膜細胞增生，防止軟骨及軟骨下骨破壞造成的關節(jié)畸形、強直，同時青藤堿還可抑制滑膜巨噬細胞樣細胞合成TNF-α，從而阻斷RA滑膜炎的發(fā)展[16-17]。錢鑫等[18]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以抑制RA患者體內(nèi)炎癥反應，改善炎性損傷和臨床癥狀，同時抑制血清類風濕因子、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體的表達，從而發(fā)揮免疫抑制作用。結(jié)合本研究結(jié)果可進一步證實青藤堿通過改善機體炎癥反應、調(diào)控免疫功能，從而緩解關節(jié)疼痛、僵直、腫脹及骨破壞，提高治療效果。

綜上所述，青藤堿治療氣陰兩虛型RA的臨床效果顯著，可抑制MyD88依賴性信號通路，減輕炎癥反應，從而改善關節(jié)疼痛、腫脹等臨床癥狀，安全性良好。