Curcumin協同ABT-737對肝癌細胞上皮間質轉化的抑制作用及相關機制初步研究

鄭銳年 孫成暉 賈筠 林順歡 林欽雄 劉淳 郝艷艷 潘學兵 何宇 邵俊偉

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]。雖然肝癌研究在診斷、治療和基礎研究方面均取得了長足的進步，但肝癌的預后并沒有得到顯著的改善，易出現轉移復發[2-3]上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在腫瘤轉移的多個步驟發揮了重要的作用[4]。在肝癌細胞轉移過程中，轉錄因子如Snail、Slug、ZEB、Twist通過下調E-cadherin等黏附分子，并上調一系列金屬基質硫蛋白酶MMP，促進肝癌轉移[5]。Wnt/beta-catenin信號通路是肝癌發生過程中所需的關鍵信號通路之一[6]。在肝癌中，beta-catenin 的活化可使得Wnt/beta-catenin信號異常活化[7-8]?；罨腷eta-catenin/TCF信號在肝癌細胞生長，遷移和轉移中都有重要功能[9]。ABT-737作為抗凋亡蛋白的小分子抑制劑，對肝癌細胞有一定的殺傷作用。姜黃素Curcumin是一種植物提取物，對多種腫瘤細胞均有抑制效果，其中包括肝癌。在前期研究中，筆者發現Curcumin可以協同ABT737激活JNK信號途徑，促進肝癌細胞的凋亡，從而抑制肝癌細胞HepG2的生長[10]。本研究以肝癌7404細胞為對象，并建立的肝癌動物模型(Alb-Cre；P53f/f；Ras)，探討Curcumin協同ABT-737作用對肝癌細胞上皮間質轉化的影響，并探討JNK-beta-catenin信號通路是否參與EMT轉化的影響，初步闡明Curcumin協同ABT-737對肝癌細胞上皮間質轉化的抑制作用，以期為肝癌的靶向治療提供一個新的方式。

資料與方法

一、一般資料

胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素購自北京中山生物公司生物技術有限公司；RPMI 1640培養液購自美國Gibco公司；Curcumin(分子式C21H20O6，相對分子質量368.4，純度≥99%)購自美國Sigma生物試劑公司；ABT-737購自美國Sigma-Aldrich公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl nuoride，PMSF)購自上海浩然生物技術有限公司；ⅪPA裂解液和考馬斯亮藍G250購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人Vimentin、N-cadherin、ZEB1、E-cadherin、p-beta-catenin、p-JNK、Snail、Twist和GAPDH多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒均購自Biotechnology公司；Matrigel基質膠購自北大醫學部細胞生物學實驗室。

二、研究方法

(一) 細胞、細胞培養及實驗動物 肝癌7404細胞由中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈。

8只4～6周齡肝癌動物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(滬)2003-0003，平均體質量為18～22 g。

(二) 細胞實驗分組及細胞形態學的改變 取對數生長期的7404細胞接種于6孔培養板中(2×105個/孔細胞)進行常規培養，次日細胞融合度達50%～70%時進行實驗。7404細胞實驗分4組：1% DMSO溶劑對照組、2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/L ABT-737作用組和2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用組。收集藥物處理48 h后的各組細胞，在倒置顯微鏡下觀察各組7404細胞的生長狀態及形態學改變，并對其進行定量。

(三)細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力 7404細胞接種于6孔培養板中(2×105個/孔細胞)進行常規培養24 h，細胞融合度達90%時，移液槍頭在直尺的協助下做劃痕，PBS洗滌3次，劃痕處未脫落細胞，隨后在顯微鏡下對劃痕進行拍照(0 h)。根據分組情況，加入相應的培養基，將培養板置于培養箱中培養24 h后再次置于顯微鏡下對劃痕進行拍照。計算各組劃痕面積修復率(%)=[劃痕創傷面積(0 h)-劃痕創傷面積(24 h)]/劃痕創傷面積(0 h)×100%，并實驗重復3次，計算平均值。以對照組劃痕面積修復率為100%，獲得各組細胞的相對遷移能力。

(四) 蛋白質印跡法檢測各組細胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和ZEB1蛋白的表達

(1)細胞樣品100 μL含PMSF的RJPA裂解液，搖勻后在冰上放置30 min；離心后收集上清液，用考馬斯亮藍G250結合法測定蛋白質濃度。

(2)取總蛋30 μg/孔上樣，進行SDS-PAGE，轉膜，封閉2 h。

(3) 洗滌后與特異性一抗：E-cadherin抗體、Vimentin抗體、N-cadherin抗體、ZEB1抗體和GAPDH內參37 ℃反應2 h后，4℃過夜；二抗孵育室溫2 h，DAB顯色。

(4)結果用TotalLab 2.0軟件進行灰度值分析，以目的蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度表示目的蛋白的相對表達水平,重復4次。

(五)蛋白質印跡法檢測各組細胞p-beta-catenin、p-JNK、Snail 和 Twist蛋白的表達

(1)細胞樣品100 μL含PMSF的RJPA裂解液，搖勻后在冰上放置30 min；離心后收集上清液，用考馬斯亮藍G250結合法測定蛋白質濃度。

(2)取總蛋30 μg/孔上樣，進行SDS-PAGE，轉膜，封閉2 h。

(3) 洗滌后與特異性一抗：p-beta-catenin抗體、p-JNK抗體、Snail抗體、Twist抗體和GAPDH內參37 ℃反應2 h后，4 ℃過夜；二抗孵育室溫2 h，DAB顯色。

(4)結果用TotalLab 2.0軟件進行灰度值分析，以目的蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度表示目的蛋白的相對表達水平,重復4次。

(六)肝癌動物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)的建立 通過將Alb-Cre工具鼠與P53f/f;Ras小鼠雜交形成。在Ras基因的前面有一個終止密碼子。在該終止密碼子作用兩側有兩個Loxp位點。在Alb-Cre作用下，剔除P53 的表達，同時激活Ras的表達，由此誘導肝癌的發生。在小鼠4月齡時，通過灌胃的方式，對小鼠進行處理。小鼠分為兩組，每組4只，分別接受Curcumin協同ABT737[40 mg/(kg·d)+40 mg/(kg·d)]、以及對照生理鹽水藥物處理，共處理30 d。3個月后，處死小鼠，收集小鼠的肝組織，進行HE染色，檢測腫瘤數量，采用液基薄層制片(TCT)計算肝轉移瘤數量。

三、統計學分析

結 果

一、Curcumin協同ABT-373抑制7404細胞遷移

在倒置顯微鏡下觀察發現，1% DMSO溶劑對照組、2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/L ABT-737作用組的7404細胞拉長，由多邊形向長梭形轉變，細胞間隙增寬，細胞梭形化明顯；2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用組的7404細胞間隙增寬，有些細胞皺縮，細胞內顆粒增多，折光性降低，細胞碎片增多。與1% DMSO溶劑對照組(290.25±13.23)、2 μmol/L Curcumin作用組(278.75±5.12)、5 μmol/L ABT-737作用組(269.00±8.83)比較，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用組(152.00±11.05)7404細胞梭形化明顯減少(P<0.05) (圖1 A)。在細胞劃痕實驗中，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用組較其他三組細胞的遷移能力顯著降低(P<0.05) (圖1 B)。

A：Curcumin協同ABT-373抑制7404細胞遷移，并對其進行定量；B：Curcumin協同ABT-373抑制7404細胞對劃痕面積的修復，并對其進行定量

二、 Curcumin協同ABT-373抑制原發性肝癌細胞肝內轉移

給藥治療30次后，取出肝臟，蘇木精伊紅染色并計數肝轉移瘤數量，Curcumin + ABT-737治療組(7.25±4.03)肝癌動物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)中肝轉移瘤數量明顯小于對照組(25.25±6.40)，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

Curcumin協同ABT-373抑制原發性肝癌細胞體內轉移，并對在肝臟形成的轉移灶進行數量統計

三、 Curcumin協同ABT-737調控EMT相關分子的表達

蛋白質印跡法檢測結果顯示，相比1% DMSO溶劑對照組、2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/L ABT-737作用組，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用后，7404細胞中E-cadherin蛋白的表達水平明顯上調，Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表達水平明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)(圖3 ，表1)。

表1 Curcumin，ABT-737對EMT相關蛋白的影響

2 μmol/L Curcumin協同5 μmol/L ABT-373在7404細胞中抑制間質細胞標記分子Vimentin、N-cadherin、ZEB1的表達，上調上皮細胞的標記分子E-cadherin的表達。

四、 Curcumin協同ABT-737上調JNK1的磷酸化水平、beta-catenin的磷酸化水平，抑制Snail、Twist的表達

蛋白質印跡法檢測結果顯示，相比1% DMSO溶劑對照組、2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/LABT-737作用組，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用后，7404細胞中JNK1和beta-catenin的磷酸化水平明顯上調，Snail、Twist蛋白的表達水平明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)(圖4 ，表2)。

2 μmol/L Curcumin協同5 μmol/L ABT-373在7404細胞中抑制beta-catenin下游靶基因Snail、Twist的表達，上調beta-catenin和JNK的磷酸化水平。

表2 Curcumin，ABT-737對beta-catenin和JNK的磷酸化水平的影響

討 論

腫瘤細胞易發生侵襲和轉移，其可以從原發灶脫落，侵襲基底膜，進而侵入血管、淋巴管或體腔形成微小轉移灶[11]。多項研究證實，EMT在腫瘤的侵襲和轉移過程中扮演著重要角色，參與并促進腫瘤細胞的浸潤和轉移過程。

EMT是指上皮細胞在正常生理和特定病理情況下向間充質細胞轉化的現象。發生EMT后，細胞極性喪失，排列變得紊亂；另外，上皮細胞標記物如E-cadherin、ZO-1、claudin-1等表達下調，而間質細胞標記物如N-cadherin、Vimentin等表達升高。處于相對靜止的細胞變得活躍，并且常伴有穿透細胞外基質的能力增強，提高了細胞的侵襲、轉移能力[12]。本研究結果顯示，相比2 μmol/L Curcumin作用組、5 μmol/L ABT-737作用組，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用后，7404細胞梭形化明顯減少(P<0.05)，細胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表達水平明顯抑制(P<0.05)，E-cadherin蛋白的表達水平明顯上調(P<0．05)，而且，Curcumin + ABT-737治療組肝癌動物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)中肝轉移瘤數量明顯小于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，說明Curcumin協同ABT-737能抑制肝癌細胞上皮間質轉化。

最新的研究表明，腫瘤細胞通過EMT還能獲得腫瘤干細胞的特性，而腫瘤干細胞的存在是化療耐藥及化療后腫瘤復發的的根本原因之一[13]。EMT過程主要通過調控Snail、Slug、ZEB、Twist等轉錄因子實現，這些轉錄因子通過下調E-cadherin等黏附分子，與肝癌轉移的密切相關[14]。本研究結果顯示，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737處理后，Snail、Twist，Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表達水平明顯下調，而E-cadherin蛋白的表達明顯上升，而單獨處理這兩種藥物，這些蛋白的表達并沒有明顯改變，說明兩種藥物的聯用可以顯著抑制肝癌7404細胞上皮間質轉化。

在前期研究中，筆者發現Curcumin可以協同ABT-737抑制肝癌細胞HepG2的生長，與JNK信號途徑的激活有關。本研究結果表明，2 μmol/L Curcumin + 5 μmol/L ABT-737作用后，7404細胞中JNK1和beta-catenin的磷酸化水平明顯上調，說明Curcumin協同ABT-737激活JNK-beta-catenin信號途徑，下調Snail、Twist蛋白的表達，進而上調E-cadherin蛋白的表達，且下調Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表達，導致肝癌7404細胞上皮間質轉化抑制，進而說明JNK-beta-catenin可能參與EMT轉化的抑制。

綜上所述，Curcumin協同ABT-737能抑制肝癌細胞上皮間質轉化，JNK-beta-catenin可能參與EMT轉化的抑制。本研究結果為肝癌靶向EMT的治療提供了一種新的方式。