荷花花粉活力的檢測方法比較分析

梁露 孔德政 劉卓星 李瀚純 劉青青 劉鳳欒 張大生 田代科

摘要：為探究快速有效地檢測荷花花粉活力的方法，選出適用于大部分荷花花粉萌發的培養基，篩選花粉活力較高的品種，以11份不同資源荷花的花粉為材料，利用離體培養法、I2-KI染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法對荷花花粉活力進行檢測。結果表明，I2-KI染色法和TTC染色法檢測得到的花粉染色率均與離體培養得到的萌發率結果不符。易建蓮花粉萌發率在5-1培養基（10%PEG 4000、0.02%硼酸、0.1%蔗糖）上最高，為9.86%。野生蓮中的泰國蓮、越南蓮的花粉離體萌發率分別為16.45%、16.67%，品種荷花中單灑錦的離體萌發率則高達18.46%。由研究結果得出：（1）3種花粉活力測定方法中，離體培養法適用于檢測荷花的花粉活力，而I2-KI染色法和TTC染色法并不適合;（2）適合荷花花粉萌發的培養基是含10%PEG 4000、0.02%硼酸、0.1%蔗糖的液體培養基;（3）野生蓮中，泰國蓮、越南蓮的花粉活力較高，而在品種荷花中，單灑錦的花粉活力最高。

關鍵詞：荷花;花粉活力;染色;培養基;I2-KI染色法;TTC染色法

中圖分類號：S682.320.1 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0131-06

收稿日期：2021-05-11

基金項目：上海市綠化和市容管理局科技攻關項目（編號：G162402、G182412）。

作者簡介：梁 露（1996—），女，河南信陽人，碩士研究生，主要從事園林植物育種研究。E-mail：1165134110@qq.com。

通信作者：田代科，博士，研究員，博士生導師，主要從事觀賞植物資源分類評價、種質創新及重要性狀遺傳機制研究。E-mail：dktian@cemps.ac.cn。

蓮別稱荷花，是蓮科（Nelumbonaceae）蓮屬（Nelumbo）的多年生挺水植物，是最古老的雙子葉植物之一，目前僅存有美洲蓮（Nelumbo lutea）和亞洲蓮（N. nucifera）2個種。荷花集觀賞、食用、藥用等功能于一體，具有重要的文化價值、經濟價值、生態價值[1-2]。

花粉是植物體上起生殖作用的雄配子體[3]，其活力直接影響到植物受精和結實過程，較高的花粉活力可以提高植物的結實率和育種成效。荷花花粉含有豐富的類黃酮，目前針對荷花藥用價值的研究較多[4-5]，而對其活力的研究較少[6]。全世界目前已有的2 000多個荷花品種主要由中國和日本培育而成[7]，育種方法主要是自然雜交和人工雜交，少部分采用物理或化學誘變方法[8-10]，然而在荷花雜交過程中常出現不結實或結實率低的問題。因此，了解花粉活力情況對于荷花雜交育種過程至關重要，如不同種類的荷花花粉活力是否存在差異及差異多大，如何更有效地檢測荷花的花粉活力，如何更有效地儲藏花粉使其活力保存較長時間等問題目前尚不清楚。

離體培養法和染色法是測定植物花粉活力的常用方法，已經在百合[11]、牡丹[12]、巴旦木[13]、菊花[14]、君子蘭[15]等植物中得到了廣泛應用。本研究以不同資源荷花的花粉為試驗材料，分別采用離體培養法、碘-碘化鉀（I2-KI）染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法進行活力檢測，以離體培養法作為參照，比較2種染色方法的測定結果，從而對不同資源荷花的花粉活力進行比較分析。

在對荷花進行人工雜交前，先對花粉活力進行準確有效的檢測，選出花粉活力強的品種作為父本，進而選擇合適的雜交母本，是保證雜交育種工作順利開展和提高效率的重要條件。本研究期望得出有效、快速地檢測荷花花粉活力的方法，從而篩選出花粉活力較高的荷花品種，為荷花新品種的高效培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

表1中的試驗材料為取自上海辰山植物園國家荷花資源圃的11份不同資源的荷花，包括美洲蓮、亞洲蓮及亞美雜交蓮，均為單瓣型（圖1），因考慮到單瓣型荷花雄蕊發育正常，花粉活力通常更高。試驗材料采集時選擇天氣晴朗的08：00左右，選取開花第2天的荷花，荷花花蕾在開花前用種子袋套上，避免因蜜蜂采蜜導致授粉雜交。試驗于2020年7—9月在上海辰山植物園中國科學院上海辰山植物科學研究中心的觀賞植物資源及創新利用研究組247實驗室內完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉的收集 用一次性唇刷將花粉從花藥上輕刷下來，放在培養皿中的硫酸紙上，蓋上培養皿備用。

1.2.2 培養基的選擇 影響花粉萌發的主要因素有蔗糖、硼酸等[16]。聚乙二醇（PEG）可以促進種子萌發[17]，也可以使花粉緩慢水合，從而較長時間地維持花粉膨壓，對花粉萌發也有一定的促進作用[18-20]。由前期的試驗結果可知，荷花在固體培養基上的萌發率較低，結合孫春青等的方法[21]，最終選用液體培養基。

為了得到適用于大多數荷花花粉萌發的培養基，設置PEG-4000（含量分別為0、10%、15%）、蔗糖（含量分別為0、5%、10%）、硼酸（含量分別為0、0.01%、0.02%）3個因素的3個水平，共設計15種組成不一的培養基（表2），并選擇3個荷花品種的花粉做培養基篩選試驗，分別為粉霸王、易建蓮、巨姚。分別將3個荷花品種的花粉撒于15種培養基上，在培養箱中于30? ℃培養4 h后，使用奧林巴斯BX43正置顯微鏡，在放大10倍的條件下觀察花粉的萌發情況，統計萌發率。在離體培養法中，當花粉管的長度大于花粉粒的直徑時視為萌發[22]。上述每個處理設置3個重復，每個重復觀察3個視野。

1.2.3 離體培養法 配制培養基，將培養基置于干凈的凹面載玻片上，取花粉均勻撒在培養基上，然后將其放入內置濕潤濾紙的培養皿中，在培養箱中于30 ?℃培養4 h后，鏡檢觀察花粉的萌發情況，統計萌發率。每個處理設置3個重復，每個重復觀察3個視野。

1.2.4 I2-KI染色法 配制I2-KI溶液（稱量 0.2 g KI溶于8 mL蒸餾水中，充分溶解后，加入 0.1 g I2定容至30 mL，振蕩使其充分溶解）于棕色滴瓶中，避光備用。取適量花粉于PCR管中，將PCR管用錫箔紙包裹避光，再向管中加入200 μL I2-KI 溶液，輕輕振蕩混勻，然后在黑暗條件下染色5 min。滴2～3滴染色液于載玻片上，鏡檢觀察，被染成藍色的花粉視為有活力，未被染色的花粉則視為無活力。上述每個處理設置3個重復，每個重復觀察3個視野。

1.2.5 TTC染色法 配制0.5%TTC溶液（稱量0.05 g TTC溶于10 mL磷酸緩沖液中）于棕色滴瓶中，避光備用，溶液需現配現用。取適量花粉于PCR管中，將PCR管用錫箔紙包裹避光，再向管中加入200 μL TTC溶液，輕輕振蕩混勻，然后放入 37? ℃ 培養箱中黑暗染色15 min。滴2～3滴染色液于載玻片上，鏡檢觀察，被染成紅色的花粉是有活力的，未被染色的花粉是無活力的。上述每個處理設置3個重復，每個重復觀察3個視野。

1.3 數據處理

用Excel對數據進行統計分析。離體培養法的花粉活力計算公式：花粉萌發率=已萌發的花粉粒數/花粉粒總數×100%;染色法的花粉活力計算公式：花粉染色率=已染色的花粉粒數/花粉粒總數×100%。

2 結果與分析

2.1 培養基的篩選

如圖2所示，在PEG-4000濃度為0的培養基上，1-1、1-2、1-3、1-4、1-5培養基中的花粉未萌發;在PEG-4000含量為15%的培養基上，3-2、3-3、3-4、3-5培養基中的花粉幾乎未萌發（萌發率<1%）;在 PEG-4000含量為10%的培養基上，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5培養基中的花粉萌發情況較好。由此看出，適宜含量的PEG-4000確實可以提高荷花花粉的萌發率，但當含量過高時，反而會抑制其萌發。同時發現，蔗糖含量為0時，花粉的萌發率較高，蔗糖含量為5%、10%時，花粉的萌發率偏低，表明萌發率隨著蔗糖含量升高而降低。而花粉萌發率在硼酸含量為0.02%的培養基上較高，在硼酸含量為0.01%的培養基上較低。在2-5培養基上，易建蓮荷花品種的平均花粉萌發率最高。綜合考慮，為了滿足大多數荷花的花粉都能良好萌發且萌發條件一致，選擇2-5培養基用于花粉萌發。

選擇易建蓮進行進一步的試驗，然而由于2-5培養基的蔗糖含量為0，因此設定PEG-4000含量為10%、硼酸含量為0.02%，添加不同含量的蔗糖再次進行培養基試驗。由表3可以看出，易建蓮花粉在5種培養基上的萌發率隨著蔗糖含量的升高而先升高后降低，在5-1培養基上達到最高值，為9.86%，說明一定濃度的蔗糖可以促進花粉萌發，但當蔗糖含量過高時，花粉萌發反而被抑制。最終選擇5-1培養基作為測定荷花花粉活力的液體培養基，其配方：10%PEG-4000+0.02%硼酸+0.1%蔗糖。

2.2 2種染色法的觀測效果

在本試驗中，I2-KI染色法、TTC染色法均能對荷花的花粉進行有效染色（圖3-B、圖3-C）。在顯微鏡下，花粉形態清晰，但2種染色方法的著色區分度有較大差異。經I2-KI染色后，大多數荷花花粉均呈褐黑色或黃褐色，極少數有未著色的花粉粒。經TTC染色后，荷花花粉呈紅色或淡紅色，部分花粉粒未著色，易區分。

2.3 3種花粉活力檢測方法的比較

用3種方法檢測荷花花粉活力發現，離體培養法和TTC染色法檢測得到的所有荷花花粉的活力均低于45%，而I2-KI染色法檢測得到的荷花花粉活力均高于70%（表4、圖3）。

離體培養法使用前期試驗得到的最適培養基來檢測不同荷花的花粉活力。由圖4可以看出，用離體培養法檢測得到11種不同資源的荷花花粉萌發率均低于20.00%，其中單灑錦的花粉活力最高，為18.46%，黑龍江野生蓮的花粉活力最低，為6.70%。

使用I2-KI染色法測定荷花花粉活力時，染色后的花粉呈褐黑色或黃褐色，在顯微鏡觀察下發現其色差不明顯，同時花粉著色率極高，僅有少數花粉未著色。因此，如果僅以著色率來表示花粉的活力，那么I2-KI染色法檢測得到的不同荷花花粉的活力均超過70%（圖5），這與離體培養得到的結果嚴重不符，因此認為這種染色法不適合用于檢測荷花花粉的活力。

使用TTC染色法測定荷花花粉活力時，不同荷花檢測得到的花粉活力差別較大。由圖6可以看出，越南蓮的花粉活力最高，達到了43.39%，江溪紅蓮的花粉活力最低，為11.24%。與離體培養結果比較可知，TTC染色法測得的花粉活力明顯偏高，此方法雖然容易操作，染色后花粉的著色情況容易區分，但是得到的結果普遍高于離體培養法，且與離體培養中得到的染色率比例不一致，不能準確反映花粉活力，因此該方法也不適用于荷花花粉活力的檢測。

3 討論與結論

花粉活力直接影響雜交授粉后卵子受精和結實率的結果，因此，雜交育種試驗之前需要了解荷花花粉的活力，優先選擇花粉活力高的品種作為父本，更利于新品種的成功培育[23-25]。測定花粉活力的方法較多，不同植物適用的檢測方法不同。花粉活力檢測多采用染色法，因其操作過程簡易、試驗耗時少、能在較短時間內測定花粉活力等優點而被應用于各種植物中。研究發現，大部分檢測方法得到的花粉活力高于實際活力[3]。孫光玲等研究發現，花粉活力的測定以離體培養法更可靠[26]。于璐通過對不同番茄品種花粉活力的測定得出，TTC染色法比I2-KI染色法更適用[27]。王士泉對于四川牡丹同時使用亞歷山大染色法、TTC染色法和I2-KI染色法進行花粉活力的測定，并對其結果進行比較，認為四川牡丹更適用I2-KI染色法[28]。詹妮等發現，用離體培養法、過氧化物酶法和I2-KI染色法檢測的大葉相思的花粉活力無顯著差異[29]。

本試驗選用離體培養法、I2-KI染色法和TTC染色法來檢測荷花的花粉活力。試驗得到適合所取試驗材料萌發的培養基是含10%PEG 4000、0.02%硼酸、0.1%蔗糖的液體培養基。本試驗結果表明，不同種類荷花花粉活力有一定差異，甚至有的花粉活力差異十分顯著。在野生蓮中，泰國蓮、越南蓮的花粉活力最高，而黑龍江野生蓮的花粉活力最低，可能因為泰國蓮和越南蓮是熱帶蓮，與北方資源相比更適應上海夏季的高溫，而我國北方的黑龍江野生蓮屬于從北向南的引種，表現出長勢較弱和開花較少的特點，有些北方資源南移到上海后甚至不長立葉，因此適應能力較弱。在品種荷花中，單灑錦的花粉活力最高，推測可能與該品種適應性強、能夠從古流傳至今有一定關系。

比較3種花粉活力的測定方法可知，I2-KI染色法、TTC染色法均不適合用于荷花花粉活力的檢測。離體培養法利用培養基對荷花花粉進行離體培養，雖然可以進行大量樣本測定，但培養時間較長，不適合用于花粉活力的快速測定。在本研究中，離體培養法得到的荷花花粉萌發率均較低，分析其原因可能有以下幾點：（1）荷花的花粉活力本身就低;（2）本試驗的培養基未使荷花花粉達到最大萌發率，有的花粉粒出現破裂的情況，培養基組分還需要進一步探索優化;（3）培養時間長，花粉活力與實際值相比可能偏低。I2-KI染色法操作簡便快速，只需將花粉與染色液混合，并在室溫下避光放置一段時間即可檢測花粉活力。此方法是根據淀粉遇碘變色的原理，變色情況受淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉比例的影響，直鏈淀粉遇碘變藍色，支鏈淀粉遇碘變紫紅色[30]。而在本試驗中，染色后觀察到花粉呈褐黑色、黃褐色，分析認為可能是染液的顏色加上直鏈淀粉變藍及支鏈淀粉變紫紅色疊加呈現的顏色。依據花粉內淀粉的染色情況來判斷花粉活力可知，很可能出現已失活花粉內有淀粉尚未水解的情況，此時花粉仍然會被染色，就可能導致染色率遠高于離體培養中觀察到的結果。在實際操作過程中，TTC染色法染色液需要現配現用并避光放置，將花粉與染色液混合，并在37? ℃恒溫避光放置一段時間才可檢測花粉活力，對試驗操作技術的要求較高，很容易出現染色失敗、花粉均無法著色的情況，而且其染色結果與離體培養的結果不一致，染色率高于離體萌發率，與郭蓓等的研究結果[31]一致，此方法原理是無色的TTC與正常活細胞中的脫氫酶反應變成紅色。而部分活力弱的花粉也會產生脫氫酶，雖然含量低，但也會被染成淡紅色。經分析認為，可能是本試驗中的荷花花粉中部分活力弱的也著色了，淡紅色與紅色混合在一起，無法完全準確判定其真實顏色，導致在判斷過程中受到主觀影響，結果比實際萌發率偏高。在這種情況下，TTC染色法得到的荷花花粉著色率仍然較低，說明荷花花粉活力確實偏低。

由此可見，不同種類的植物適用的花粉活力檢測方法各不相同，因此需要通過試驗來進行比較分析，選擇出最適合研究對象的測定方法。本試驗采用的離體培養法適合荷花花粉活力檢測，但效率不高。I2-KI染色法和TTC染色法雖然快速簡便，但結果并不準確，不適合荷花花粉活力的快速檢測。因此，后續仍然需要繼續試驗，找到更好的快速準確的荷花花粉活力檢測方法。

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