邯鄲某雞場禽源空腸彎曲菌的分離鑒定與耐藥性情況

李晶晶，劉彥威，劉建釵

（河北工程大學，河北邯鄲 056000）

隨著養殖業的迅速發展， 禽類疾病的種類越發復雜，且不同疾病的癥狀與病變的相似之處越來越多， 臨床上準確診斷出疾病愈發困難，傳統的診斷方法不能準確診斷出疾病，所以怎樣對病雞做出最準確的診斷就顯得尤為重要，而細菌的分離鑒定就能做到準確診斷疾病。

細菌性的疾病， 雖然有與之相符的抗生素對其進行抑制，但是現在存在著很多問題。 現在面臨的問題是很多的細菌已經對一些常用的抗生素產生耐藥性，并且這種耐藥性還可以通過這種菌上的耐藥基因進行一代代的傳遞，這會對疾病的治療產生很大的影響，使此類疾病的病程延長，治療成本加大，產生更大的損失。并且細菌產生耐藥性會使大多數常用的抗生素對此病菌效果不顯著甚至無效，所以細菌分離鑒定后的藥敏試驗可以有效地指導臨床用藥，讓疾病得到最為高效的治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥敏試驗質控菌株（大腸桿菌25922、空腸彎曲菌NCTC11168） 為河北工程大學獸醫實驗研究所保存。

1.1.2 培養基和試劑 改良CCD瓊脂培養基、Cary-Blair 氏運送培養基、 改良CCD 瓊脂添加劑、 布氏肉湯、Bolton 肉湯、脫纖維羊血、MH（A）培養基，青島海博生物技術有限公司產品； 微需氧厭氧袋，日本三菱公司；TAE 緩沖液，康為世紀生物科技有限公司產品；載玻片，秦皇島市東風醫用玻璃廠產品； 草酸銨結晶紫染液產品、 革蘭氏碘液、90%乙醇、番紅染液，常德比克曼生物科技有限公司產品；瓊脂糖，西班牙Agarose 產品；甘油，天津歐博凱化工有限公司產品。

1.1.3 藥敏試紙 藥敏紙片，上海源葉

1.1.4 主要儀器 摩爾基因超純水器， 德國Millipore 公司； 立式自動電壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫療設備有限公司； 電子顯微鏡， 日本Olympus 公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；數控恒溫水浴鍋，常州易晨儀器制造有限公司；臺式高速旋轉離心機，德國Eppendorf 公 司 ；Bio-Rad 凝膠成像分析系統，上海勤翔科學儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養箱，上海龍躍儀器設備有限公司；2.5升密封培養罐，日本三菱公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 空腸彎曲菌的分離 接種環沾取少量泄殖腔拭子， 在改良mCCDA 培養基劃線分離，并將培養板放入厭氧培養袋或培養罐中，放入微需氧產氣袋密封， 42℃溫箱內培養48 小時后看結果。 對疑似菌落，呈扁平狀或透明水滴樣再進行增菌劃線培養。

1.2.2 空腸彎曲菌的鑒定 對有明顯空腸彎曲菌的菌落形態，進行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察，并采用水煮法提取DNA，通過空腸彎曲菌hipO 基因鑒定。 引物序列見表1。

表1 引物序列基因

PCR 反應體系為25 微升：2×Taq PCR Master Mix 12.5 微升，hipO 基因上下游引物各1 微升，DNA 模板2 微升，ddH2O 補齊25 微升。

PCR 反應程序為95℃5 分鐘；95℃30 秒，60℃30 秒，72℃1 分鐘，72℃，7 分鐘。 PCR 產物在1%的瓊脂糖電泳， 凝膠成像系統下觀察結果，并采集圖像。

1.2.3 空腸彎曲菌K - B 紙片法藥敏試驗

對采樣分離所得的禽空腸彎曲菌分離株，運用K-B 紙片法進行藥物敏感性試驗， 根據對公共衛生的影響和臨床重要性，選擇使用氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類、氟喹諾酮類、β-內酰胺類、林可酰胺類六類6 種抗生素藥敏紙片進行藥敏驗證。將貼好藥敏片的平板倒置與厭氧袋一起放于厭氧罐中，42℃厭氧培養48 小時后，測量抑菌圈直徑， 并以大腸桿菌25922 作為質控株，根據CLSI 發布的標準判斷樣本菌株對各藥物敏感（S）或耐藥（R）。

藥敏片詳細信息參考表2

表2 藥敏片及判定標準

2 結果與分析

2.1 空腸彎曲菌分離與鑒定

空腸彎曲菌在mCCDA 培養基上呈灰色、濕潤、凸起光滑的水滴樣菌落，非常小，比大腸桿菌小一些(如圖1)；革蘭氏染色，呈弧形、S 型彎曲狀(如圖2)； 經過擴增特異性hipO 基因后，1×瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物片段，大小基本相同，條帶一致，并處在預期序列大小范圍內（目標片段735bp）（見圖3）。 結果顯示，從邯鄲某養雞場采集的150 份雞泄殖腔拭子， 共分離出14 株空腸彎曲菌分離菌。

圖1 菌落形態鑒定

圖2 革蘭氏染色

圖3 分離株普通PCR 鑒定

2.2 空腸彎曲菌分離株的耐藥情況

KB 紙片法檢測結果表明，14 株分離菌對六種抗生素耐藥情況最高的是紅霉素， 其次是環丙沙星（見圖4）。

圖4 耐藥情況

3 討論

空腸彎曲菌廣泛存在于多種畜禽、 野鳥等動物腸道內。 本試驗主要是從蛋雞禽泄殖腔拭子分離培養空腸彎曲菌，培養過程中，需要的條件比較苛刻，需要較低含量的氧氣，不像大腸桿菌在正常空氣中37℃就能長的很好， 空腸彎曲菌長時間暴露在空氣中也會導致其死亡，本身培養所用的培養基成本也比較高，在這種情況下，如何快速劃線培養及鑒定就成為了成功分離空腸彎曲菌的關鍵，從流行病學來說具有深遠的價值意義。

彎曲菌對大多數抗生素敏感， 彎曲菌種類的分化可能有助于選擇適當的抗生素治療。 尤其像空腸彎曲菌對氟喹諾酮類、大環內酯類、氨基糖苷類和β-內酰胺類表現出不同程度的耐藥，耐藥趨勢的發展已經引起世界各國的廣泛關注。 人類臨床上最常用的治療藥物是大環內酯類如紅霉素和氟喹諾酮類如環丙沙星，從本次藥敏試驗結果也能得到紅霉素有明顯耐藥情況。

4 小結

檢測空腸彎曲菌的方法很多，各有利弊，建立一個更快速簡便、更穩定可靠、更高效準確、更低成本的檢測技術是保證公共衛生和食品安全的迫切需求。 可以預見，多種檢測技術的有機結合和優勢互補有望解決上述需求。