河南省白靈側耳菌株遺傳多樣性分析

孔維威 袁瑞奇 康源春 張玉亭 周舒浩 常曉超 劉洋洋

（河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所，河南 鄭州 450002）

農業種質資源是保障國家糧食安全和重要農副產品有效供給的戰略性資源。2020年，國務院辦公廳出臺“關于加強農業種質資源保護與利用的意見”，提出開展系統收集保護，實現應保盡保，要強化鑒定評價，提高利用效率等。2021年河南省農業農村廳印發《河南省農業種質資源普查總體方案》，計劃利用3年時間在全省組織開展農業種質資源普查，摸清河南省農作物、畜禽、水產和食用菌種質資源家底。2019年河南省食用菌各類品種生產量折合55億袋以上，鮮菇產量達到540.94萬噸，產值397.70億元，產量和產值繼續居全國第一位[1]。出口創匯14.9億美元，占2019年全省農產品出口額的69.63%[2]。

白靈側耳（Pleurotus tuoliensis）[3,4]商品名為白靈菇，是我國具有自主知識產權和明確原產地的品種，也是最早被列入我國植物新品種保護名錄（第六批）的食用菌品種（2005年5月20日農業部令第51號公布施行）。2019年全國白靈側耳產量為5.7881萬噸，比2018年增長3.67%[1,5]。白靈側耳雖已人工栽培多年，但工廠化栽培菌株的農藝性狀和商品性狀還有待改進，原基誘導難、一致性低和生產周期較長是目前產業發展遇到的主要瓶頸問題。因此，加快選育白靈側耳工廠化生產優良性狀新品種是當務之急。

菌株遺傳多樣性是育種改良的基礎。菌株遺傳多樣性分析的方法較多，張金霞等[6]研究發現白靈側耳的IGS1區域較保守，菌株間沒有多態性；IGS2區域較廣、變異多，是種內遺傳多樣性分析和菌株鑒定的有效標記區域，IGS2結合限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，準確性和可重復性好，是白靈側耳種內遺傳多樣性和菌株鑒定鑒別的有效方法。本文廣泛收集河南省內的白靈側耳菌株32個，采用拮抗反應和IGS2-RFLP方法對其遺傳多樣性進行分析，以期為雜交選育白靈側耳新品種的親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料見表1。現保藏于河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所河南省食用菌種質資源庫（Henan Mushroom Germplasm Resources Bank，HMGRB）。

表1 白靈側耳供試菌株

1.2 方法

（1）拮抗反應。不同菌株間區別性鑒定采用拮抗法[7]。

（2）DNA提取。將低溫保存的菌種連續活化2次后接種于PDA培養基平板上培養10天，然后使用孔徑5 mm的打孔器打取10個菌種塊轉移至裝有100 mL PD液體培養基的250 mL三角瓶中，25 ℃下150 r/min培養7天。10 000 r/min離心收集菌絲，液氮速凍后-80 ℃超低溫冰箱保存備用。采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物公司）提取DNA。

（3）IGS2-PCR。擴增體系采用2X高保真PCR Mix預混液（上海生工生物公司）和Primer各1.5μL，Template約25 ng，用ddH2O補齊至50 μL。上游引物：5'-ACTGGCAGAATCAACCAGGTA-3'，下游引物：5'-ACCGCATCCCGTCTGAT-3'。反應條件：94 ℃變性4 min；94 ℃變性1 min，56 ℃復

2 結果與分析

2.1 親和性反應

不同菌株間存在拮抗反應，交界處菌絲一般呈現隆起型、溝型和隔離型3種反應類型。本試驗結果表明，大部分白靈側耳菌株間都為隆起型，少部分菌株間是溝型，極少數出現隔離型的現象。Pt1、Pt5和Pt22這3個菌株相互間無拮抗反應。

2.2 IGS2-PCR分析

由圖1可知，應用IGS2片段的特異引物進行擴增，不同酶對供試菌株的IGS2-PCR產菌株間IGS2片段大小不同，數量在2～8條之間。

圖1 白靈側耳供試菌株IGS2-PCR擴增圖譜

2.3 IGS2-RFLP及聚類分析

用HpaII、RsaⅠ和HaeIII等3個限制性內切物進行酶切，結果（圖2）顯示每個菌株均存在3種酶的酶切位點，但酶切位點不同，各菌株電泳后產生的帶型圖譜也不同。3種限制性內切酶酶切一共產生36個片段，其中有差異性的片段28個，占總帶數的77.8%。采用最遠鄰法進行聚類分析，構建分子系統樹（圖3）。

圖2 白靈側耳不同菌株IGS2-RFLP 電泳圖譜

圖3 供試菌株的IGS2-RFLP聚類樹狀圖

基于HpaII酶切的電泳圖譜聚類分析結果為，在相對距離10下，可以將32個菌株分為3組，其中1、2、3、4、5、6、7、10、11、13、14、15、16、18、23、25、27、28、31、32號菌株為I組，9、17、19、20、22、24、26、29、30號菌株為II組，8、12、21號菌株為III組。基于RsaⅠ酶切和HaeIII酶切的電泳圖譜聚類分析結果表明，這2個酶切后I組菌株與HpaII酶切的聚類結果完全一致，差別在于29號菌株是屬于II組（RsaⅠ酶切），還是III組（HaeIII酶切）。組內各菌株的聚類關系也略有差異。

3 結論與討論

目前我國已選育出一些白靈側耳栽培種，其中通過國審的有4個品種。從子實體形態上主要分為掌狀、扇狀、匙狀、馬蹄狀等。由于各單位引種途徑不一，引種后又自行命名，造成名稱比較混亂，在河南省尤為嚴重。IGS序列是核糖體RNA（rRNA）的重要組成元件，包括IGS（intergenic sparer）1和IGS2 這2個區域[8]。IGS序列的多態性研究發現，白靈菇和香菇不同菌株或不同品種之間存在多態性，可以用于菌株鑒別[6,9]。趙夢然等[10]比較白靈側耳野生菌株的遺傳多樣性后發現，多態性檢測效率最高的標記為ISSR，其次是IGS2-RFLP，最后是SCoT。3種標記中，SCoT和ISSR標記的聚類結果極其相似，均能較為準確地反映樣本的地理來源；IGS2-RFLP的標記效率較高，準確性和可重復性好，可用于菌株標準圖譜的制作，更適用于品種權保護中的菌株鑒定鑒別。

本研究共收集河南省內白靈側耳菌株32個，應用拮抗反應和IGS2-RFLP法對這些菌株進行遺傳多樣性分析，結果發現大多數菌株間具有拮抗反應，僅Pt1、Pt5和Pt22等3個菌株相互間無拮抗反應。IGS2-RFLP法采用3種限制性內切酶，對白靈側耳的IGS2擴增產物進行酶切，均具有良好的特異性、穩定性和可重復性，酶切圖譜具豐富的多態性，不同菌株間有差異。基于上述結果對收集到的白靈側耳菌株遺傳多樣性進行分析，最終將這些菌株分為親緣關系較遠的3組，其中25號（國審品種中農翅鮑）和32號（許白2號）菌株位于第I組，24號（國審品種中農1號）菌株位于第II組，其余菌株分屬于三組之中。而菌株29號經3個酶酶切后的聚類分析分組位于第II組或第III組。此結論為今后新品種雜交選育親本的選擇提供參考和選擇依據。