基于網絡藥理學的“檳榔-草果-厚樸”配伍治療糖尿病腎病作用機制探討

白曉甜 南 征 宋超群 劉世林

糖尿病腎病（Diabetic kidney disease，DKD）是臨床常見的糖尿病并發癥。2019 年流行病學調查顯示[1]，全球20～70 歲成年人中糖尿病發病率高達9.3%，而DKD 患病人數隨糖尿病發病率升高也成比例增長。DKD 以持續性蛋白尿和腎功能進行性下降為主要表現，并且多伴有高血壓和眼底病變，最后進展為終末期腎病。研究顯示，DKD為發達國家和地區終末期腎病的首要原因。對于此病，現代醫學多從降血糖、降血壓、降血脂、抗炎、抗氧化應激等方面治療[2]。中醫藥在此病的治療上發揮了其獨特優勢[3]。尚鑫等[4]應用參芪地黃湯治療早期糖尿病腎病，患者SCR、BUN、UAER等指標均較治療前明顯改善。王澤等[5]研究發現六味地黃丸可降血糖、血壓、血脂，改善腎功能，對于肝腎陰虛型糖尿病腎病療效確切。吳修紅等[6]將當歸補血湯加味用于糖尿病腎病的治療，結果發現其可明顯改善患者腎功能，增強患者免疫機能并且減輕機體炎癥反應。南征教授將“檳榔-草果-厚樸”三藥應用于糖尿病腎病的治療，經過多年臨床實踐，收獲良效。

本研究通過網絡藥理學的方法[7]，從檳榔、草果、厚樸三味藥的成分及作用靶點出發，分析其治療糖尿病腎病的作用機制，為導師南征教授運用此三味藥治療本病提供相關佐證，并為糖尿病腎病的治療提供相關理論參考。

1 資料與方法

1.1 藥物成分篩選及其靶點收集和規范應用TCMSP 平 臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharamacology Database and Analysis Platform）對檳榔、草果、厚樸三味中藥化學成分進行搜索，并根據ADME 參數進行篩選，保留口服生物利用度（OB）≥30%同時類藥性（DL）≥0.18的活性成分。同時通過查閱三味藥物治療糖尿病腎病有關資料補充相關活性成分。最后通過TCMSP 平臺收集活性成分作用靶點，并通過UniProt數據庫對相關靶點名稱進行規范。

1.2 構建藥物-成分-靶點網絡將藥物、成分、靶點相關信息導入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制藥物-成分-靶點網絡圖，并根據degree 值提取相關性強的活性成分。

1.3 疾病靶點收集和規范應用GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD 四個數據庫，以糖尿病腎病為主題詞進行檢索，收集、篩選并匯集糖尿病腎病中相關基因，同樣用UniProt數據庫規范相關靶點名稱。

1.4 確定藥物與疾病的交集靶點將收集好的藥物相關靶點和疾病相關靶點導入網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），繪 制Venny圖，獲取“檳榔-草果-厚樸”藥對與糖尿病腎病的交集靶點。

1.5 蛋白相互作用網絡構建將所獲取的藥物與疾病的交集靶點導入STRING 11.0 平臺（https://www.string-db.org/），將物種設定為“Homo sapiens”，設定最小互相作用值（minimum required interaction score）>0.9，其余設置為默認值，獲取蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI網絡），并將網絡導入Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡處理。

1.6 藥物與疾病靶點功能與通路富集分析將檳榔、草果、厚樸三味藥物治療糖尿病腎病的靶點導入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），選擇物種為Homo sapiens 進行生物學功能及通路的富集分析，并應用相關平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）對數據進行可視化。

1.7 藥物活性成分-疾病-靶點-通絡網絡圖的構建應用Cytoscape 3.7.2軟件構建檳榔、草果、厚樸成分-糖尿病腎病-靶點-通路網絡。

2 結果

2.1 藥物活性成分靶點獲取通過TCMSP 平臺，初步獲得檳榔化學成分52 種，篩選之后獲得8 種；初步獲得草果化學成分59 種，篩選后獲得8 種；初步獲得厚樸化學成分139 種，篩選后獲得2 種。因篩選具有相關局限性，故通過收集相關文獻補充檳榔成分1種，厚樸成分2 種。經過篩選和補充，三藥的主要成分包括槲皮素（quercetin）、和厚樸酚（honokiol）、厚樸酚（Magnolol）、(+)-表兒茶素（ent-Epicatechin）、原花青素B1（Procyanidin B1）等，具體成分見表1。通過對成分的再次檢索，獲得檳榔、草果、厚樸活性成分對應的靶點分別為41 個、174 個和94 個，三藥靶點匯集并去重后共獲得靶點191個。

表1 檳榔-草果-厚樸三藥主要成分表

2.2 藥物成分靶點網絡圖制作根據藥物成分及靶點制作相關network 文件和type 文件，并將文件導入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制藥物-成分-靶點網絡圖，見圖1。通過軟件內置Network Analyzer，根據degree 值提取位于前十的活性成分為槲皮素（quercetin）、和厚樸 酚（honokiol）、厚 樸 酚（Magnolol）、桉 葉 油 醇（Eucalyptol）、(+)-表兒茶素（ent-Epicatechin）、(-)-兒茶素[(-)-catechin]、原花青素B1（Procyanidin B1）、鄰苯二甲酸二己酯（WLN:6OVR BVO6）、(4E,6E)-1,7-二(4-羥基苯基)-4,6-庚二烯-3-酮[(4E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)hepta-4,6-dien-3-one]、新 橙 皮 苷（Neohesperidin）。主要成分degree值見表2。

圖1 藥物-成分-靶點網絡圖

表2 關鍵成分degree值表

2.3 疾病相關靶點獲取從GeneCards 數據庫中獲取糖尿病腎病靶點3459個，設定Score>中位數后獲取靶點1751 個，通過DrugBank、OMIM、TTD 三個數據庫對糖尿病腎病靶點進行補充，經過匯總去重復值后共獲得糖尿病腎病靶點1784個。

2.4 藥物與疾病的交集靶點獲取將藥物靶點和疾病靶點分別導入相關網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），繪制藥物疾病靶點交集Venny 圖，見圖2，并獲取藥物與疾病的交集靶點，共115個。

圖2 檳榔-草果-厚樸與糖尿病腎病交集靶點Venny圖

2.5 蛋白相互作用網絡構建將所獲取的藥物與疾病的交集靶點導入STRING 11.0 平臺，經過最小互相作用值>0.9 篩選后獲得靶點104 個，并構建蛋白相互作用網絡（PPI 網絡），并將網絡導入Cytoscape 軟件，利用軟件的NetworkAnalyzer功能對網絡進行分析，使PPI網絡圖中的節點根據degree值呈現大小與顏色深淺的變化（節點越大、顏色越深表示degree 值高），見圖3。再根據degree值排序獲得藥物作用于疾病的關鍵靶點為AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA等。

圖3 “檳榔-草果-厚樸”糖尿病腎病靶點PPI網絡圖

2.6 生物學功能與通路富集分析將檳榔-草果-厚樸與糖尿病腎病交集靶點導入DAVID 數據庫進行生物學功能及通路的富集分析，并對結果進行可視化，如圖4～圖7。

圖4～圖7 藥物治療疾病靶點功能與通路的富集分析圖

2.7 藥物成分-疾病-靶點-通絡網絡圖的構建制作成分、疾病、靶點、通路相關network 文件和type 文件，導入Cytoscape軟件構建藥物成分-疾病-靶點-通絡網絡圖，同樣使用Network Analyzer 功能對網絡進行分析，使PPI 網絡圖中的節點根據degree 值呈現大小與顏色深淺的變化（節點越大、顏色越深表示degree值越高），見圖8。可知，關鍵靶點為AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA；關鍵 通 路為PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、FoxO等信號通路。

圖8 成分-疾病-靶點-通路網絡圖

3 討論

3.1 “檳榔-草果-厚樸”的作用檳榔為達原飲之君藥，草果、厚樸為達原飲之臣藥，三藥共同構成了達原飲開達膜原、辟穢化濁的基礎。檳榔是棕櫚科植物檳榔的干燥成熟種子[8]，功能殺蟲、行氣、利水、消積、截瘧。草果為姜科植物草果的干燥成熟果實，有燥濕溫中、截瘧除痰之功效。厚樸為木蘭科植物厚樸的干燥干皮、根皮、枝皮，可行氣燥濕消痰、下氣除滿平喘。三藥皆為辛溫之藥，相輔相成，功效顯著。檳榔雖歸經于陽明[9]，其疏利之性卻能透腸胃、搜膜原；草果雖歸于脾經，其烈性卻可透脾臟達膜原；厚樸行氣散結之力強，可在兩藥引導之下直擊伏于膜原之邪并導之以出。歷代醫家多應用達原飲治療瘧疾、疫戾之病。現代醫家在此基礎上，將達原飲應用于更廣泛的領域。楊進教授[10]將達原飲的治療思路運用到多種疾病的治療上，將檳榔、草果、厚樸三藥應用于濕濁郁閉三焦之口腔潰瘍、干燥綜合征等。吳耀南[11]運用達原飲治療慢性肝病，認為此病為邪氣伏于膜原，故從膜原論治。陳蓓華[12]以檳榔、草果、厚樸為主藥治療小兒病毒性腦炎，總有效率達90.5%。林霜霜[13]還將達原飲加減應用于小兒腸系膜淋巴結炎。在新型冠狀病毒肺炎的治療上，余漢先[14]認為，達原飲能祛胸中膜原之邪，若理化檢查符合肺外帶、肺下葉毛玻璃影等指征時可以達原飲為底方進行治療，對患者病情有顯著的改善作用。田和炳[15]將檳榔、草果、厚樸作為新型冠狀病毒肺炎瘥后防復的宣透方，以達膜原清透余邪，改善瘥后不適癥狀。

“膜原”一詞最早見于《黃帝內經》，其廣泛分布在人體，內與臟腑相連，外與體表相通，并與三焦有關。明代吳又可在《溫疫論》提出疫戾邪氣從口鼻侵犯人體，病位不在臟腑和經絡，而為半表半里之膜原，并運用達原飲開達膜原、辟穢化濁以治療瘟疫之氣伏于膜原[16]。南征教授在繼承膜原理論的基礎上，結合多年臨床經驗認為，膜原非獨疫病可侵入，頑固、穢濁之邪同樣可入膜原[17]。消渴腎病是由于消渴日久，臟腑功能失常，毒邪伏于膜原，損傷腎絡所致，關鍵病機為毒損腎絡。本病之毒邪深藏膜原，故藥難及，邪難出。所以在治療時運用“達膜原”的方法，用達原飲中三味主藥檳榔、草果、厚樸，其中檳榔辛散化濁，厚樸行氣散結，草果芳香辟穢。三藥合用可直達膜原，使深伏之毒邪潰敗，祛毒邪外出，在本病的治療上發揮了重要作用。

3.2 “檳榔-草果-厚樸”的藥理學分析現代藥理研究顯示，檳榔的成分有生物堿、酚類、氨基酸、維生素等[18]。具體成分包括原花青素A1、原花青素B1等，這類物質具有良好的抗氧化作用，可以應用于氧化應激損傷造成的多種慢性疾病。袁列江等[19]在研究檳榔提取物時發現，不同提取方式提取的檳榔活性成分均能在抗氧化方面發揮相應作用。姚起鑫等[20]研究發現檳榔堿能夠調節糖代謝及脂代謝，其降糖原理是減少肝臟糖異生。草果中含有多種活性成分[21]，如酚類、黃酮、揮發油、花青素以及微量元素等，揮發油為其主要成分,草果揮發油[22]的兩種成分可協同促進細胞凋亡和抗腫瘤。草果甲醇提取物具有抗氧化活性作用，還可降低甘油三酯和血糖。厚樸的化學成分[23]主要為酚性化合物及揮發油等。厚樸酚、和厚樸酚為主要酚類活性物質，可明顯改善機體糖脂代謝，同時抗炎、抗氧化，和厚樸酚還有治療腹瀉、抗抑郁、降血糖的作用。厚樸揮發油（主要為桉葉油醇）及黃酮等成分也有良好的抗炎、抗氧化作用。

以往對檳榔、草果、厚樸單獨的藥理研究很多，但對于三藥共同作用的研究相對缺乏，其對糖尿病腎病治療方面的藥理研究也相對匱乏。本研究通過對檳榔、草果、厚樸三藥的活性成分如槲皮素、和厚樸酚、厚樸酚、(+)-表兒茶素、原花青素B1等的分析，找到其治療糖尿病腎病的相關靶點共115個，主要有AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA 等，經過通路與生物進程分析找到三藥發揮作用的生物學通路主要是PI3KAkt、HIF-1、MAPK、FoxO等信號通路。相關具體分析如下。

3.2.1 藥物活性成分分析 槲皮素為黃酮類化合物，生物活性及藥用價值都很高，具有抗炎、抗氧化的作用，對糖尿病腎病有很好的療效。靳麗英等[24]通過研究發現槲皮素可通過增強podocin4（足突蛋白）及nephrin（腎病蛋白）的表達，減少糖尿病腎病足細胞損傷，從而降低蛋白尿。宋其蔓等[25]研究發現槲皮素可激活PI3K-Akt 信號通路，從而在糖尿病腎病患者的治療上起到抗氧化應激、抑制細胞凋亡以及增強細胞活力的作用。和厚樸酚為厚樸中含有的小分子多酚[26]，吳芳等[27]研究發現和厚樸酚具有抗炎、抗菌、抗氧化的作用，對于糖尿病腎病的氧化應激損傷具有切實的治療作用。厚樸酚對GK大鼠糖尿病腎病模型有一定的保護作用[28]，可降低血糖并降低血漿胰島素，降低尿蛋白，同時降低內生肌酐清除率。(+)-表兒茶素[29]是一種兒茶素和多酚,具有抗氧化活性。原花青素B1[30]是8種原花青素中活性最強的，可清除有毒自由基，并且有抗炎、降血脂等功用，可抑制炎癥反應，減輕細胞損傷，可預防和治療長期炎癥導致的慢性疾病，如糖尿病及其并發癥如糖尿病腎病。

3.2.2 關鍵靶點分析 AKT1 是AKT 激酶的一種。AKT 可介導葡萄糖的攝取和調節[31]。AKT1 調節許多過程，包括細胞存活、增殖、代謝、生長等[32]。MAPK1是MAP 激酶信號轉導途徑的重要組成部分，可介導多種生物學功能，如細胞生長、黏附、存活和分化[33]。TP53誘導的TRGAR[34]（凋亡調節因子）可維持細胞氧化還原穩態、調節細胞內葡萄糖代謝。IL6參與免疫、組織再生和新陳代謝，可在組織損傷期間進行宿主防御，并可通過GLP-1 介導提高胰島素敏感性，以適應胰島素需求的變化[35]。陳麗萍等[36]研究發現，IL6與糖尿病腎病炎性因子相關。IL6 可協調胰島素需求，但過量會損傷胰島細胞，且會刺激腎小球膜細胞增生。VEGFA 可誘導血管通透性增加并抑制細胞凋亡[37]。VEGF 升高可促使血管內皮功能損傷，并損傷腎臟基質及其上皮細胞[38]。

3.2.3 主要通路及功能分析 在糖尿病腎病中，PI3K-Akt 信號通路是一條重要的免疫炎癥機制通路[39]，可防止細胞凋亡、加快細胞增殖，在疾病進展過程中起重要作用。研究發現，PI3K-Akt信號通路過度激活與本病的發生密切相關[40]。HIF-1信號通路可改善缺氧[41]，但也可對本病起到促進作用。在糖尿病腎病早期，HIF-1 信號通路主要起保護作用，但在糖尿病腎病不斷進展的過程中，其誘導的細胞凋亡作用會引起腎臟受損。MAPK 信號通路能對細胞的代謝凋亡產生調控作用，可影響組織細胞糖代謝，從而影響本病進展[42]。FoxO 信號通路對葡萄糖產物的基因轉錄起到促進作用，但是FoxO 依賴的轉錄如果增強也會起反向作用，如引發高血糖。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對“檳榔-草果-厚樸”藥對治療糖尿病腎病的相關藥理機制進行了初步探究，研究結果初步預測了三味藥成分對應的靶點作用于本病的相關機制，為進一步將膜原理論應用于DKD 的治療提供了先導信息和基礎，也為網絡藥理學研究其它方藥的作用機制提供相應借鑒。