高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖工藝優化

周巖飛 吳長輝 姚渭溪 李 曄

（福建仙芝樓生物科技有限公司/國家食用菌加工技術分中心，福建福州 350002）

靈芝Ganoderma lucidum為多孔菌科真菌赤芝的干燥子實體[1]，含有多種活性成分，以靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝甾醇和核苷類為主，具有調節免疫、抗腫瘤和保肝等活性[2]。目前已經從不同來源的靈芝中分離出200 多種靈芝多糖，它們主要是由β-（1→3）-D、β-（1→4）-D、β-（1→6）-D 等幾種β-葡聚糖組成。葡聚糖是由葡萄糖單體聚合而成的一類高分子多糖，可分為α 型和β 型。常見的α-葡聚糖主要存在于淀粉、糊精和糖原，β-葡聚糖主要存在于微生物和食藥用菌等真菌中。目前藥理學研究表明，β-葡聚糖是高效的生物反應調節因子，是一種生物活性多糖，在調節免疫和抗腫瘤方面發揮著重要作用，具有重要開發應用前景[3]。靈芝的β-葡聚糖屬于胞內多糖，存在于細胞壁或細胞間質中；而靈芝子實體的細胞壁是由纖維素、半纖維素和木質素組成的致密結構，因此不易從細胞內提取出靈芝多糖。目前提取多糖的方法主要有熱水浸提法[1]、超聲輔助提取法[4]、微波輔助提取法[5]、酶法輔助提取法[6]、亞臨界水提取法[7]和超高壓提取法[8]，熱水浸提法是工業生產常用的方法，但提取時間長和能耗高限制其產業化發展；超聲輔助提取以超聲高頻振蕩產生的空穴效應破壞細胞壁使多糖溶出，但中試及產業化投資成本高；微波輔助提取以微波破壞細胞壁，但對設備要求高，樣品處理量小，會產生大量蒸汽，難以大規模應用；酶作用于靈芝中幾丁質、纖維素等物質，使其與多糖分離，不破壞多糖結構，但酶易失活，且較難把控酶的適宜pH 及最佳溫度；超微粉碎將物料粉碎成直徑小于10 μm粉體，使靈芝細胞最大限度破壁，直接釋放胞內有效成分，但存在毒性成分溶出風險，易吸附雜質[9]。亞臨界水提取基于相同原理，但是溫度和壓力要求更高，高溫易導致β-葡聚糖生物活性的下降[10]。高溫高壓水提法利用高壓和高溫對細胞壁的破碎作用使多糖溶出，該提取方法簡單可行、適用性強，可用于工業化生產。為此，筆者進行高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖的優化工藝條件，以期為靈芝的深加工提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院）、中溫α-淀粉酶（4000 U/g，上海麥克林生化科技有限公司）、糖化酶（10000 U/g，西亞化學科技（山東）有限公司）、蒽酮（AR，上海麥克林生化科技有限公司）、硫酸（AR，西隴科學股份有限公司）、純化水（RO，自制）、GMA-UN2 超純水機（北京普析通用儀器有限責任公司）、UV-2450 紫外可見分光光度計（島津制作所）、TD-5 臺式離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、HH-6 數顯恒溫水浴鍋（常州易晨儀器制造有限公司）、WGL-125B電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、LDZF-75 L-1 立式高壓滅菌器（上海申安醫療器械廠，溫度上限為137 ℃，壓力上限0.33 MPa）

1.2 材料

靈芝顆粒（批號SBB-L3C-201012）由仙芝科技（福建）股份有限公司提供，靈芝經除雜、干燥和粉碎后過篩（孔徑為840～2000 μm）。

1.3 方法

稱取靈芝顆粒若干份，每份20 g，加水后進行高溫高壓提取，提取后使用74 μm孔徑濾布過濾，濾液濃縮蒸干，烘干至恒重，稱重得到提取物質量并計算提取物得率；用水溶解提取物并定容，以無水葡萄糖為對照品，用酶解α-葡聚糖-蒽酮-硫酸法檢測β-葡聚糖總量，計算得靈芝β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數。

1.4 酶解α-葡聚糖-蒽酮-硫酸法

2020版中國藥典一部靈芝[含量測定]多糖[1]的方法中加入酶解α-葡聚糖步驟（供試品溶液的制備方法）：取烘干恒重后的提取物，加水溶解，定容至100 mL，取25 mL轉移至50 mL離心管，加入30 mg中溫α-淀粉酶，55 ℃酶解1 h；用滴管滴入1 滴（約0.002 mL）0.1 mol/L的鹽酸溶液，使其pH為4.0～4.5，加入30 mg 糖化酶，55 ℃酶解1 h；離心取上清5 mL，邊攪拌邊加入乙醇75 mL，醇沉后操作同2020版中國藥典。

1.5 高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖的工藝優化

1.5.1 單因素試驗

1.5.1.1 提取溫度對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數的影響

稱取靈芝顆粒7 份，每份20 g，料（g）液（mL）比為1∶15，提取溫度為100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃、120 ℃、125 ℃、130 ℃，提取時間為10 min，提取后操作同1.3。每組試驗重復3 次，取平均值。

1.5.1.2 提取時間對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數的影響

稱取靈芝顆粒5 份，每份20 g，料（g）液（mL）比為1∶15，提取時間為10 min、20 min、30 min、40 min、60 min，提取溫度為130 ℃，提取后操作同1.3。每組試驗重復3 次，取平均值。

1.5.1.3 料液比對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數的影響

稱取靈芝顆粒5 份，料（g）液（mL）比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，提取時間為40 min，提取溫度為125 ℃，提取后操作同1.3。每組試驗重復3次，取平均值。

1.5.1.4 提取次數對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數的影響

稱取靈芝顆粒5 份，每份20 g，料（g）液（mL）比為1∶15，提取時間為40 min，提取溫度為125 ℃，提取1、2、3、4、5 次，提取后操作同1.3。每組試驗重復3 次，取平均值。

1.5.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，用L9（34）設計正交試驗，考察提取溫度、時間、次數對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數的影響。靈芝顆粒每份20 g，每組試驗重復3 次，取平均值以確定最佳工藝條件。

1.6 不同方法提取靈芝β-葡聚糖對比

分別采用熱水浸提法[1]、超聲輔助法[4]、微波輔助法[5]和酶法輔助法[6]提取靈芝β-葡聚糖。靈芝顆粒每份20 g，每組試驗重復3 次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 測定方法和試驗參數的確定

酶解α-葡聚糖-蒽酮-硫酸法測定β-葡聚糖標準曲線見圖1。

圖1 酶解α-葡聚糖-蒽酮-硫酸法測定靈芝β-葡聚糖標準曲線

2.2 高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖

2.2.1 提取溫度對β-葡聚糖提取率及提取物中β-葡聚糖質量分數的影響

由圖2 可以看出，β-葡聚糖提取率與提取溫度成正比關系，130 ℃時提取率最高；提取物中β-葡聚糖質量分數與提取溫度成正比關系，說明隨著溫度升高，β-葡聚糖的溶出速度大于雜質的溶出速度，130 ℃時提取物中β-葡聚糖質量分數最高。綜合結果選取130 ℃作為以下試驗的提取溫度。

圖2 提取溫度對提取物中β-葡聚糖質量分數及β-葡聚糖提取率的影響

2.2.2 提取時間對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數的影響

由圖3 可以看出，β-葡聚糖提取率與提取時間成正比關系，特別是提取30 min 以后，提取率上升加快，提取60 min 時提取率最高；提取物中β-葡聚糖質量分數與提取時間成正比關系，說明延長提取時間，特別是提取30 min 以后，β-葡聚糖的溶出速度大于雜質的溶出速度，提取60 min時提取物中β-葡聚糖質量分數最高。綜合結果表明30 min 以后β-葡聚糖會加速溶出，提取60 min最佳。

圖3 提取時間對提取物中β-葡聚糖質量分數及β-葡聚糖提取率的影響

2.2.3 料液比對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數的影響

選取最佳提取溫度和時間次優點，125 ℃，40 min，料液比設定5個梯度，提取結果見圖4。

圖4 料液比對提取物中β-葡聚糖質量分數及β-葡聚糖提取率的影響

由圖4 可以看出隨著料液比上升，β-葡聚糖提取率緩慢上升，料液比1∶35以后停滯。由此得出，液料比過高，溶出雜質越多，不僅延長濃縮時間，還會導致多糖的損失，提取物中β-葡聚糖質量分數下降[11]。綜合考量，以料（g）液（mL）比1∶15為最佳。

2.2.4 提取次數對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數的影響

選取最佳提取溫度和時間次優點，125 ℃，40 min，料液比1∶15（g/mL），提取1～5 次。 結果見圖5。

圖5 提取次數對提取物中β-葡聚糖質量分數及β-葡聚糖提取率的影響

由圖5 可以看出，提取3 次即可完全提取β-葡聚糖，β-葡聚糖提取率增長趨于平緩；再增加提取次數，提取物中β-葡聚糖反而降低，說明β-葡聚糖存在溶出上限，提取次數過多反而溶出更多雜質，導致提取物中β-葡聚糖下降。綜合結果，以提取3次為最佳。

2.2.5 正交試驗

仿真的參數帶寬為800 kHz， FFT點數為4 096點，所加時延為[0 0.2 0.6 1.0 1.5 2.0]，最大多普勒頻移為4 Hz，萊斯因子等于5的萊斯信道。

選取提取溫度、時間、次數作為高溫高壓水提靈芝β-葡聚糖的關鍵因素，料（g）液（mL）比為1∶15，由于提取溫度對提取率及提取物中β-葡聚糖質量分數的影響較大；又因為立式高壓滅菌器的溫度上限為137 ℃，故溫度因素補充135 ℃水平。

試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2，β-葡聚糖提取率極差分析見表3，β-葡聚糖提取率方差分析見表4，提取物中β-葡聚糖質量分數極差分析見表5，提取物中β-葡聚糖質量分數方差分析見表6。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗

表3 β-葡聚糖提取率極差分析

表4 β-葡聚糖提取率方差分析

最佳水平為A3B1C3，提取次數對β-葡聚糖提取率影響較大，其次為溫度。

提取次數對β-葡聚糖提取率影響具有顯著性影響，提取溫度和提取時間對β-葡聚糖提取率沒有顯著性影響。

最佳水平為A3B3C3，提取溫度對提取物中β-葡聚糖質量分數影響較大，其次為提取次數。

溫度和次數對提取物中β-葡聚糖質量分數具有顯著性影響，提取時間沒有顯著性影響。

以提取物中β-葡聚糖質量分數為目標，兼顧β-葡聚糖提取率，選取A3B3C3進行重復試驗，結果見表7。

表7 重復驗證試驗結果

2.3 不同方法提取靈芝β-葡聚糖結果對比

由圖6 可以看出，高溫高壓水提取的β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數都高于熱水浸提法和其他提取方法。

圖6 不同提取方法提取β-葡聚糖效果

3 小結與討論

采用單因素試驗及正交試驗優化高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖的條件，結果表明，高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖的最佳條件為料（g）液（mL）比1∶15，提取溫度為135 ℃，提取時間為60 min，提取次數為3 次，在此條件下，提取物中β-葡聚糖的質量分數為27.03%，β-葡聚糖的提取率為3.824%。

以往研究中只注重靈芝多糖提取率[4-9]，忽視提取物中靈芝多糖質量分數，若提取時雜質溶出過多，需要更多的純化手段以提高成品中的靈芝多糖純度，從而加重多糖純化工作。筆者研究表明，與傳統的提取方法和亞臨界水提取法相比，高溫高壓水提取法明顯提高了β-葡聚糖提取率及在提取物中的質量分數，同時又避免了提取雜質溶出過多或提取溫度過高時大分子的β-葡聚糖發生分解，導致提取物中β-葡聚糖質量分數下降的弊端。高溫高壓水提取溫度為135 ℃，壓力約0.3 MPa時，β-葡聚糖的提取率比常壓的熱水提取方法提高一倍多（圖6），操作簡便安全，大幅度提高資源利用率，可進一步擴大進行工業化生產。

正交試驗提取溫度為135 ℃時，β-葡聚糖提取率最高，從圖2 的β-葡聚糖提取率上升趨勢可知，β-葡聚糖提取率并未在135 ℃達最高值。由于試驗滅菌器的溫度和壓力存在上限，今后可采用其他設備進行更高提取溫度試驗。