白靈菇液體發酵菌種培養終點初探

劉海娟 劉利娟 郭紋余 常曉寧 鄭素月 郭金英

（河北工程大學，河北邯鄲 056001）

白靈菇Pleurotus tuoliensis又名阿魏側耳、阿魏蘑菇、阿魏蘑、阿魏菇等，是一種食、藥用性都很高的珍稀食用菌。美味可口、營養豐富[1]的白靈菇不僅食用價值較高，還具有一定的藥用價值，如具有降血壓[2]、降血脂[3-4]、抗氧化、抗疲勞[5-6]、抗腫瘤、抗輻射及提高免疫力[7-8]等功效，所以常被稱為白靈芝。

液體發酵終點傳統的判斷方法主要以發酵瓶質量變化[9-10]為依據，此方法在液體發酵培養終點的報道中相對較多，但是用于食用菌方面的較少。雖然以發酵瓶質量變化為參數，結合生長曲線判斷液體發酵的培養終點方法簡便，但無法確定菌絲活力。因此，結合漆酶[11]、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶等酶活測定判斷液體發酵培養終點能判定出菌絲的老化程度，找出菌絲質量較好的發酵時間點，從而更好地應用于生產。余昌霞等[12]用傳統方法配合酶（漆酶、羧甲基纖維素、半纖維素酶）活性測定判斷草菇液體菌種的培養終點應在84～96 h。許修宏等[13]從不同添加物的角度進行木耳液體菌種老化的研究，通過測定氧化還原物質及氧化還原酶酶活性得出菌絲抗氧化能力是隨著發酵時間而變化?？寡趸芰姷木z質量較好[14]，并且用于生產后可提高菌絲對栽培基質中營養的利用率。

筆者通過對白靈菇液體發酵菌種定性、定量分析及栽培試驗，找出菌絲質量較好的發酵培養終點，以縮短白靈菇生產周期，提高生物轉化率。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為“白雜65”，由河北工程大學食用菌實驗室雜交選育而成。

1.2 供試培養基

固體培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖25 g，酵母膏7 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。

液體培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖25 g，酵 母 膏7 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，蒸 餾 水1000 mL，pH自然。

栽培料培養基：棉籽殼78%，麩皮20%，石灰1%，石膏1%，含水量約60%。

1.3 液體發酵培養方法

液體發酵培養方法參考文獻[15]。

1.4 液體菌種定性分析

1.4.1 菌球感官觀察

300 mL 三角瓶液體培養基裝液量為100 mL，接種10 mL 液體菌種，在恒溫搖床中25 ℃、轉速170 r/min進行培養。試驗設三次重復，共9瓶。從第0 天開始記錄發酵液氣味、顏色，菌球密度、顏色、外觀等。

1.4.2 顯微鏡檢檢測鎖狀聯合數量變化

用鑷子將菌球置于干凈的載玻片上，在酒精燈上將菌絲烤干，滴入1 滴結晶紫染色1～2 min，水洗，烤干，每天觀察記錄菌絲鎖狀聯合數量，并繪制出白靈菇液體發酵菌種在發酵過程中菌絲鎖狀聯合數量變化的曲線圖。

1.4.3 回接平板試驗

在超凈工作臺中，用鑷子將菌球置于PDA 平板培養基中心，在溫度為25 ℃的恒溫培養箱中培養，每12 h觀察一次菌球萌發狀態。

1.5 液體菌種定量分析鑒定

1.5.1 發酵液pH測定

在超凈工作臺中取液體發酵培養時間為第0天、第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天的10 mL發酵液于玻璃燒杯中，用pH計測發酵液pH并記錄。每組3次重復。

1.5.2 可溶性蛋白含量測定

移取2 mL 發酵液至離心管中，8000 r/min 離心10 min，取上清液即為可溶性蛋白質待測液。每隔24 h 提取一次，每個重復提取3 個待測液。蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法[16]。

1.5.3 還原糖含量測定

從發酵培養第2 天開始，每隔24 h 移取2 mL 發酵液于離心管中，4 ℃8000 r 離心10 min 取上清液即為還原糖待測液，每組3 個重復。還原糖含量測定采用DNS法[16]。

1.5.4 ABTS法測定漆酶酶活性

移取1 mL 發酵液轉移至離心管中，以12000 g離心10 min，取上清液即為漆酶粗酶液。漆酶活性測定及計算公式參考文獻[16]。

1.6 栽培方法

按照配方制備栽培料，含水量為60%。將栽培料裝入17 cm×38 cm×0.0045 cm 的高壓聚丙烯塑料袋，并在料袋中心插入錐形棒，高溫高壓滅菌鍋滅菌90 min。滅菌料袋冷卻后同時接入液體和固體菌種，接液體菌種10～20 mL（發酵培養第5 天）；固體菌種接種時，將每個固體（平板）培養基平均切4塊，每個栽培料袋接種2 塊。設3 次重復，每個重復3袋，置于培養室25 ℃避光培養發菌。菌絲長滿袋之日起進入后熟期，將后熟期結束后的菌袋置于夜晚10 ℃以下，白天15 ℃，通風良好，空氣相對濕度為85% 處，避光培養，并適時疏蕾，保證每個菌袋有1～2 個健壯的菇蕾。當菇蕾形成后將菇房溫度調整為15 ℃，空氣相對濕度為90%～95%，通風良好，自然晝夜光照。當白靈菇子實體菌蓋完全展開，菌蓋邊緣內卷、孢子尚未彈射時采收。

記錄菌絲滿袋時間、出菇日期，統計子實體鮮重，測定子實體菌蓋縱徑、橫徑、菌蓋厚度、菌柄長度，計算生物轉化率。

2 結果與分析

2.1 液體菌種定性分析

2.1.1 菌球感官變化

液體發酵培養過程中，發酵液顏色、氣味與菌球密度、顏色、外觀等都隨發酵時間的變化而變化。由表1可知，隨發酵時間延長，發酵液顏色由深棕黃色變為淺棕黃色，酵母膏氣味由濃變淡逐漸消失，且發酵后期出現酒精氣味；菌球密度由稀疏到稠密再到黏稠，菌球顏色由淺棕黃色到潔白最后呈現出中心發黃的現象，壁掛白靈菇菌絲（以下稱菌絲）由深棕黃色線條至潔白濃密。

表1 發酵液及菌球感官變化

2.1.2 顯微鏡檢測菌絲鎖狀聯合數

由圖1 可見，菌絲鎖狀聯合數量隨著發酵培養時間的延長呈現先升高后下降的趨勢。當液體菌種培養至第5 天時，菌絲鎖狀聯合數最多，為24 個。液體發酵后期，菌絲空泡現象比較嚴重，發酵前期形成的鎖狀聯合會隨著菌絲空泡加劇呈現出菌絲鎖狀聯合空心的現象，即可推測菌絲已經嚴重老化，活力降低（圖2a）。當空泡嚴重程度更加惡化時，菌絲開始斷裂出現自溶現象（圖2b）。

圖1 發酵培養過程菌絲鎖狀聯合個數

圖2 發酵培養第8天的菌絲鎖狀聯合形態（箭頭所指）

2.1.3 回接平板試驗分析

由圖3可知，隨著發酵時間延長，菌球回接平板萌發時間呈先降低再升高的趨勢。發酵第2天、第3天時，菌球回接平板萌發時間較長。當發酵培養至第5 天、第6 天時，回接平板的菌絲萌發時間最短，為16 h，此時菌絲活力較高，生長速度快。當液體發酵培養至后期時，菌球回接平板萌發時間較長，表明菌球活力下降。

圖3 液體菌種菌球回接平板萌發時間

2.2 液體菌種定量分析

2.2.1 發酵液pH變化

由圖4可知，隨著發酵時間延長，發酵液中pH變化趨勢為先上升后下降再上升。發酵后期，發酵液pH升高，推測可能由于菌絲老化嚴重，自溶或死亡，菌絲體內代謝物溶解到發酵液中導致發酵液pH升高。

圖4 發酵液pH變化

2.2.2 發酵液中還原糖質量濃度變化

由圖5可知，隨著發酵時間延長，發酵液中還原糖質量濃度總體呈下降趨勢。發酵第2 天、第3 天時，菌絲生長緩慢還原糖消耗較少；發酵第4天、第5天時，菌絲生長較快，活力較強還原糖消耗較快，推測此時菌絲可能處于對數生長期；發酵第6天開始，還原糖消耗量減少并趨于平穩。

圖5 發酵液中還原糖質量濃度變化

2.2.3 發酵液中可溶性蛋白質量濃度變化

由圖6可知，發酵第2天、第3天時，發酵液中可溶性蛋白質量濃度趨于平穩。發酵第4 天、第5 天時，發酵液中可溶性蛋白質量濃度上升，表明此時菌絲生長迅速，由菌絲體溶解到發酵液中，致使可溶性蛋白質量濃度上升。發酵第7 天、第8 天時，發酵液中可溶性蛋白質量濃度再上升，此時期菌絲因空泡導致斷裂或自溶，可能導致菌絲體內可溶性蛋白大量流失到發酵液中，從而使發酵液中可溶性蛋白質量濃度上升。

圖6 發酵液中可溶性蛋白質量濃度變化

2.2.4 漆酶酶活性變化

由圖7可知，發酵培養過程中，漆酶酶活性呈現先升高后降低的特點。發酵第2 天、第3 天時，菌絲生長速度較慢，漆酶酶活性較低；發酵培養至第4天、第5 天時，漆酶活性迅速上升，促進菌絲對營養成分的吸收，從而使菌絲生長迅速。發酵后期菌絲逐漸老化，漆酶活性也相對降低。發酵第8天時，菌絲老化嚴重甚至死亡，漆酶活性急劇下降，此時的菌絲生長較慢，甚至部分菌絲不再生長。

圖7 漆酶活性隨培養時間的變化

2.3 栽培試驗結果

2.3.1 袋料菌絲生長情況

液體菌種接種的栽培袋內菌絲生長速度明顯比固體菌種快。液體菌種菌絲滿袋時間、采收時間比固體菌種提前15 d，即栽培周期縮短15 d（表2、圖8）。

表2 菌絲滿袋時間及采收時間

圖8 培養第31天時栽培袋發菌對比

2.3.2 白靈菇子實體經濟性狀分析

由表3 可知，液體菌種栽培的子實體鮮重平均為500 g，生物轉化率為100%。固體菌種的鮮重平均為280 g，生物轉化率為56%。子實體菌蓋縱徑、橫徑，液體菌種比固體菌種好，具有顯著差異，而菌蓋厚、菌柄長度無差異。

表3 白靈菇子實體經濟性狀

3 小結

從液體發酵感官觀察得出發酵第5 天左右，菌絲生長最好。顯微鏡鏡檢鎖狀聯合、回接平板萌發試驗及漆酶酶活性測定結果表明，液體發酵第5 天時菌種活力最強。

液體發酵工藝有分批發酵[17]、連續發酵[18]和補料分批發酵[19]三種發酵方式。分批發酵中微生物生長的四個時期比較明顯、操作簡單，應用較廣泛。隨發酵時間的延長，結合發酵液中漆酶、還原糖、可溶性蛋白的含量及發酵液中pH 的變化曲線圖可推測出，白靈菇液體菌種在發酵過程中存在微生物生長的四個時期。發酵第4 天、第5 天時，菌絲處于對數生長期，此時期菌絲生物量增長較快，表明此時期菌絲活力達最強。將此時期的液體菌種接于栽培料中，菌絲滿袋時間及生物轉化率均高于常規固體菌種。因此，綜合結果表明，白靈菇液體發酵菌種培養最適時間為5 d左右。