黑水虻對三種病原菌的殺滅作用研究

王路逸，李澤軒，易 犁，馮 亮*

(1.中國地質大學(武漢)環境學院，湖北 武漢 430078；2.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062)

現代人對肉、蛋、奶等畜牧業產品的追求，使得畜牧業蓬勃發展，隨著生產規模的不斷擴大，畜禽糞便的產量也在迅速增加，僅2016年我國畜牧業產生的糞便就達到3.16×109t，帶來了嚴重的環境污染問題[1]。畜禽糞便的傳統處理方式包括焚燒法、堆肥法、沼氣法和烘干膨化法等，這些處理方法雖然能在一定程度上利用糞便資源，但也會引起包括溫室效應在內的其他環境污染問題[2-3]。畜禽糞便中通常含有大量的與畜禽各種病癥相關的病原菌，其中也不乏能引起人畜共患病的病原菌種類，如引起副傷寒的沙門氏菌等[4]。堆肥是能通過高溫有效殺滅畜禽糞便中各類有害病原菌的方法[5]，但在堆肥過程中如果處理不當，糞堆容易對周邊的土壤環境、水環境造成污染，并對附近的人、動物、植物健康產生威脅。近年來出現了多種生物治理糞便污染的方法來解決這一問題，如黑水虻(HermetiaillucensL.)處理糞便技術則是其中的方法之一。

黑水虻，又名亮斑扁角水虻，原產于南美洲地區，雙翅目水虻科扁角水虻屬，是一類營腐生的昆蟲[6]。黑水虻的幼蟲食量大、抗逆性強，能夠快速處理包括糞便在內的有機廢棄物，同時能生產諸如畜禽飼料、生物柴油和抗菌活性物質等多種具有經濟價值的附加產品，是一種頗具應用前景的資源昆蟲[7-10]。長期的試驗研究發現，黑水虻在處理畜禽糞便時能有效殺滅糞便中的各類病原菌，包括食品防疫過程中重點關注的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等[11-13]，但不同時期的試驗結果并不完全一致，且對于同種病原菌如沙門氏菌等的殺滅規律也有存在矛盾的地方，這可能是試驗條件的不同所致[14]。

黑水虻幼蟲具有殺滅病原菌的能力通常被認為來源于其作為昆蟲所具有的高效免疫防御系統，這種免疫防御系統由抗菌肽、凝集素和溶菌酶等物質與具有多種功能的血細胞共同構建，同時昆蟲腸道內的微生物菌群也能對外源病原菌起到一定的抑制作用[15-17]。然而，在黑水虻殺滅病原菌的各種研究中，均只對黑水虻殺滅病原菌的規律做了詳細的闡述，缺乏對相關殺滅機制的探討，特別是具體到某種抑菌物質。

為了解決以上問題，本研究展開了黑水虻幼蟲處理病原菌的試驗，喂養黑水虻幼蟲的飼料包括兩種，分別為含病原菌菌液的無菌常規飼料和富含各類病原菌的雞糞飼料，用以探究黑水虻幼蟲對于某種病原菌殺滅的具體規律，并通過分離黑水虻幼蟲的淋巴體液，對其中的抑菌物質溶菌酶的活性進行了檢測，嘗試解釋黑水虻幼蟲殺菌的機制，為黑水虻處理糞便這一技術的發展提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的制備

1.1.1 供試黑水虻幼蟲的制備

黑水虻蟲卵來自于華中農業大學微生物農藥國家工程研究中心自行建立的水虻飼養平臺，將黑水虻蟲卵置于28℃培養箱中孵化，于干凈飼料中培養至3日齡。

1.1.2 飼料的制備

黑水虻常規飼料主要成分是麩皮和玉米粉，將其以3∶2的比例混合，在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、30 min下反復滅菌3次，確保各類植物孢子被有效殺滅，保證無菌條件；雞糞飼料來自于華中農業大學實驗雞場，兩種飼料使用時保持含水量在70%左右。

1.1.3 供試病原菌的制備

本試驗選用的病原菌分別是:①大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)，菌種編號ATCC43889；②沙門氏菌(Salmonella)，菌種編號ATCC14028;③金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，菌種編號ATCC43300。3種病原菌均來源于實驗室前期購買保種，以甘油形式保存。

3種病原菌的活化均采用胰蛋白胨大豆肉湯和其相關的瓊脂培養基，配制方法為100 mL蒸餾水對應添加1.7 g胰蛋白胨、0.3 g大豆蛋白胨、0.5 g氯化鈉、0.25 g磷酸氫二鉀、0.25 g葡萄糖，瓊脂培養基額外添加2 g瓊脂，混勻后調節pH值至7.3±0.2，于115℃下滅菌30 min后使用?；罨桨笧閷?種甘油菌分別涂布于胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養基上劃線，并在37℃恒溫倒置培養16 h，隨后挑取單菌落接種于10 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，置于恒溫搖床中37℃、200 r/min過夜培養16 h，得到活化菌液。

后續平板計數使用相對應的選擇性顯色固體培養基，其中大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)使用的是伊紅美藍培養基，陽性菌落呈帶有金屬光澤的黑色；沙門氏菌(ATCC14028)使用的是SS培養基，陽性菌落帶有黑色中心；金黃色葡萄球菌(ATCC43300)使用的是甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，陽性菌落呈黃色且帶有黃色環。以上培養基均購自于青島海博生物技術有限公司，產品為含瓊脂成分的粉末，按照產品說明添加至錐形瓶中與對應量蒸餾水混合，隨后置于高壓滅菌鍋中121℃、30 min滅菌，最后傾倒在一次性培養皿中制成固體培養基，備用。

1.2 病原菌飼養方法

1.2.1 病原菌飼料飼養法

該試驗設計在一個封閉的室內環境中進行，通過空調保證試驗環境室內溫度在(25±3)℃，以經過滅菌處理的泡沫盒為飼養容器，泡沫盒密封但鉆有小孔以利于透氣。試驗組分為3個小組，分別對應添加大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)、沙門氏菌(ATCC14028)、金黃色葡萄球菌(ATCC43300)3種病原菌，每個試驗組的對照組不添加黑水虻幼蟲，其他條件類似，每個小組3個生物學重復。

試驗設計飼養18 d，每6 d作為一個試驗周期。第0天向飼養箱中添加250 g已滅菌的常規飼料，再分別添加對應的3 mL已過夜活化培養的病原菌菌液，攪拌均勻，取部分飼料樣品進行病原菌平板計數，確定初始病原菌濃度，最后加入600只3日齡黑水虻幼蟲進行處理。之后試驗組每2 d從飼養箱中取出若干只黑水虻幼蟲和5 g蟲沙(黑水虻幼蟲糞便)，對照組則取飼養箱中的5 g飼料剩余物，作為蟲沙的參照，供后續試驗。第6天取樣之后，再往飼養盒中添加250 g含病原菌的飼料，保持每2 d取一次黑水虻幼蟲以及蟲沙樣品。第12天之后，打開泡沫盒，不再取樣直到第18天收集全部蟲沙樣品。本試驗方法主要參考文獻[14]。

1.2.2 雞糞飼料飼養法

飼養環境同上述飼養方法，但以雞糞為飼料對黑水虻幼蟲進行飼養。試驗組添加500 g雞糞和600只幼蟲，對照組只加入雞糞，每組3個生物學重復。試驗設計飼養14 d，第0天便加入全部量的雞糞與3日齡黑水虻幼蟲，并保存部分初始雞糞樣品，之后試驗組每2 d取5 g蟲沙樣品。對照組每2 d取5 g雞糞，作為試驗組蟲沙的參照，以上雞糞和蟲沙樣品均保存至-80℃冰箱中。

1.3 病原菌數量關系的測定方法

1.3.1 平板計數法

對于病原菌飼料飼養試驗中病原菌存活數量的檢測采用平板計數法，即試驗期間每次收集完病原菌飼料飼養試驗得到的蟲沙和飼料樣品之后，當天就進行梯度稀釋，再涂布于上述配制好的選擇性顯色固體培養基中，最后進行計數。具體方案為：將得到的蟲沙和飼料剩余物樣品按照1∶10(W/V)比例添加pH值為7.4的PBS緩沖液，經振蕩混勻后，靜置10 min，取上清液；再使用PBS緩沖液進行10倍梯度連續稀釋，取適宜稀釋度的100 μL溶液，涂布于對應病原菌的選擇性顯色固體培養基上，于37℃恒溫條件下倒置培養24 h，選擇顯陽性顏色的菌落計數，每個樣品3個平行。該方法檢測的極限是100 CFU/g，如果提高涂布的溶液量至1 mL即可提高檢測極限到10 CFU/g。同時，對第6天和第12天取得的黑水虻幼蟲進行體內病原菌檢測，同樣使用梯度稀釋和平板計數法，但需要進行提前處理，具體操作為：先將黑水虻幼蟲經半天的饑餓處理，隨后用無菌水清洗表面，放入酒精中浸泡2 min，去除體表微生物，再用無菌水沖洗3次，擦干后放入2 mL滅菌離心管中；然后按照1∶10(W/V)的比例加入pH值為7.4的PBS緩沖液，倒入無菌碾缽中充分搗碎，經高速離心機以2 000 r/min轉速離心5 min，得上清液后，進行梯度稀釋和涂布平板計數。

1.3.2 高通量病原菌芯片檢測法

由于雞糞微生物群落復雜，傳統的涂布平板計數法存在多種菌體干擾的問題，而基于SmartChip Real-Time PCR System的高通量病原菌芯片檢測法則是通過檢測各種病原菌的毒力基因或者16S rRNA相關基因的絕對拷貝數來作為病原菌總體存活數量的指標，有效避免了病原菌培養和計數困難的問題，因此對于雞糞喂食試驗中病原菌存活數量的檢測則可以采用此方法。試驗所用基因信息，見表1。

表1 試驗所用基因信息

本檢測由廣東美格基因科技有限公司完成，具體檢測流程為：先將上述雞糞飼養試驗中得到的蟲沙、雞糞樣品送往公司進行總DNA的提??；隨后利用相關芯片進行熒光定量PCR，以確定各種反應的CT值；最后代入根據混合質粒做成的標準曲線，則可推算出樣品中各種病原菌相關檢測基因的絕對拷貝數。

1.4 溶菌酶活性的檢測

將上述病原菌飼料飼養試驗得到的幼蟲樣品進行表面除菌處理，用采血針刺破尾部，收集淋巴體液[21]，將體液以3 000 r/min轉速離心15 min，取上清液得到粗酶液。后續溶菌酶活性檢測方法主要參考《溶菌酶活性檢測方法》(GB/T 30990—2014)，具體步驟為：將購買于上海保藏生物技術中心的溶壁微球菌凍干粉按照產品說明進行活化，制備成溶液；然后用0.1 mol/L pH值為6.4的PBS緩沖液將標準溶液配成一定濃度的菌懸液，使其在分光光度計450 nm波長下檢測光密度值約為0.7；最后取3 mL該菌懸液與100 μL粗酶液于試管中混勻，采用分光光度計于450 nm波長處測定其光密度值A0，并置于37℃水浴保溫30 min，取出后立刻置于冰浴中10 min以終止反應，測定其在450 nm波長處的光密度值A，即溶菌酶活性(U)=(A0-A)/A0。對照組為無菌飼料喂養的同條件黑水虻幼蟲，每個樣品類型均為3個生物學重復。

1.5 數據處理方法

本研究主要通過Microsoft Excel 2019對數據進行整理和處理，并作圖。

2 結果與分析

2.1 黑水虻幼蟲對病原菌飼料中病原菌的殺滅效果

黑水虻幼蟲對病原菌飼料中大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)、沙門氏菌(ATCC14028)和金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的殺滅效果，見圖1。

圖1 黑水虻幼蟲對病原菌飼料中病原菌的殺滅效果

由圖1(a)可以看出：

(1) 試驗組中，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)的第一次接種濃度為106.9～107.1CFU/g，在第2～4天濃度快速下降，第6天其濃度降低到檢測極限以下；在第6天大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)第二次接種后，其濃度達到105.6～105.8CFU/g，在第6～10天，相較第一次接種，其濃度下降的速度更快，并于第10天其濃度降低到檢測極限以下。

(2) 對照組中，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)的第一次接種濃度為 106.8～107.0CFU/g，在失去了黑水虻幼蟲處理后，飼養箱中無菌的飼養環境給予了大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)適宜的繁殖條件，在第0～2天其濃度快速提高，但是在第2～4天其濃度開始急速下降，第4～6天其濃度下降速度變緩；在第6天大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)第二次接種后其濃度仍呈下降趨勢，直至第18天依舊能檢測到大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)的存在。后續黑水虻幼蟲體內檢測試驗發現，第6 天和第12天的黑水虻幼蟲經饑餓處理之后體內均檢測不到大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)。

由圖1(b)可以看出：

(1) 試驗組中，沙門氏菌(ATCC14028)的第一次接種濃度為105.8～106.1CFU/g，在第2～4天其濃度快速下降，第4天其濃度降低到檢測極限以下，在第6天沙門氏菌(ATCC14028)第二次接種后，其濃度達到105.7～105.9CFU/g，于第8天其濃度降低到檢測極限以下。

(2) 對照組中，沙門氏菌(ATCC14028)的第一次接種濃度為106.1～106.3CFU/g，與大腸桿菌O157∶H7對照組類似，在失去了黑水虻幼蟲處理后，飼養箱中無菌的飼養環境使得沙門氏菌(ATCC14028)在第0～2天快速繁殖，其濃度迅速提高，而在第2～6天其濃度開始下降；第二次接種沙門氏菌后，雖然沙門氏菌(ATCC14028)濃度呈一定的下降趨勢，但在第18天仍能在病原菌飼料中檢測到沙門氏菌的存在。后續黑水虻幼蟲體內檢測試驗發現，第6天和12天的黑水虻幼蟲經饑餓處理之后體內檢測不到沙門氏菌(ATCC14028)的存在。

由圖1(c)可以看出：

(1) 試驗組中，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的第一次接種濃度為106.8～107.1CFU/g，在第2～6天其濃度下降，但未降低到檢測極限以下，在第6天仍能檢測到一定數量金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的存在，最后其濃度為101.0～101.2CFU/g；第二次接種金黃色葡萄球菌(ATCC43300)后，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)濃度達到106.7～106.9CFU/g，第6～12天其濃度呈下降趨勢，但經過第2個處理周期，乃至第3個處理周期后，在第18天，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)仍未被殺滅至檢測極限以下，最后其濃度為101.6～102.0CFU/g。

(2) 對照組中，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的第一次接種濃度為106.5～106.8CFU/g，其濃度與大腸桿菌O157∶H7對照組和沙門氏菌對照組類似，呈先上升再下降的趨勢，均不能降低到檢測極限以下；在第二次接種到與試驗組近似濃度后，后續能檢測到的濃度水平均低于試驗組。后續黑水虻幼蟲體內檢測試驗發現，第6天經過涂平板發現黑水虻幼蟲體內能夠檢測到金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的存在，而第12天的黑水虻幼蟲體內則檢測不到金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的存在。

綜上所述，黑水虻幼蟲能對病原菌飼料中攝取的3種病原菌產生一定的殺滅作用。在試驗條件下，3日齡黑水虻幼蟲在4～6 d的處理時間內就能將大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)的濃度降低到檢測極限以下，可殺滅絕大部分的金黃色葡萄球菌(ATCC43300)；9日齡黑水虻幼蟲在2～4 d的處理時間內就能將大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)的濃度降低到檢測極限以下，可殺滅絕大部分金黃色葡萄球菌(ATCC43300)，但不能將金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的濃度降低到檢測極限以下。

2.2 黑水虻幼蟲對雞糞中病原菌的殺滅效果

黑水虻幼蟲對雞糞中病原菌的殺滅效果，見圖2。

圖2 黑水虻幼蟲對雞糞中病原菌的殺滅效果

由圖2(a)可知：試驗組中，在第0～2天，eaeA基因的拷貝數下降幅度較大，達到了69.4%，在第2～8天，eaeA基因的拷貝數的下降趨勢變緩，直至第8天，eaeA基因的拷貝數才降低到檢測極限以下；對照組中，在第0～2天，eaeA基因拷貝數先呈下降趨勢，在第2～4天，eaeA基因的拷貝數呈一定的上升趨勢，之后第4～14天，eaeA基因的拷貝數才呈現穩定下降的趨勢，直到試驗結束的第14天，與初始雞糞中eaeA基因的拷貝數相比，其總體下降了79.3%。

由圖2(b)可知：試驗組中，在第0～8天，invA基因的拷貝數的下降趨勢相比eaeA基因要較為平緩，但同樣在第8天，invA基因的拷貝數降到檢測極限以下；對照組中，invA基因的拷貝數也呈現一個相對穩定的下降趨勢，在第14天，與初始雞糞中invA基因的拷貝數相比，其下降了73.8%。

由圖2(c)可知：試驗組中，在第0～4天，sec基因的拷貝數呈現一定的下降趨勢，但4 d的處理時間，sec基因的拷貝數只下降了42.6%，而在第4～6天，sec基因的拷貝數又出現上升趨勢，隨后在第6～12天，sec基因的拷貝數才呈現穩定的下降趨勢，直至第12天，sec基因的拷貝數降低到檢測極限以下；對照組中，在第0～8天，sec基因的拷貝數總體呈現一個上升的趨勢，第8～14天，sec基因的拷貝數則呈現一個下降的趨勢，在第14天，與初始雞糞中sec基因的拷貝數相比，其下降了48.9%。

綜上所述，在試驗條件下處理雞糞時，黑水虻幼蟲對從雞糞中攝取的3種病原菌具有一定的殺滅作用，8 d的處理時間內能將大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)基因的拷貝數降低到檢測極限以下，12 d的處理時間內能將金黃色葡萄球菌(ATCC43300)基因的拷貝數降低到檢測極限以下；而不經黑水虻幼蟲處理的自然條件下，各病原菌基因的拷貝數也會降低，但均不能降低到檢測極限以下。

2.3 黑水虻幼蟲體內溶菌酶活性的檢測結果

經病原菌飼料喂養之后，各試驗組與對照組黑水虻幼蟲體內的溶菌酶活性變化，見圖3。

圖3 黑水虻幼蟲體內的溶菌酶活性變化

由圖3可知：經病原菌飼料喂養之后，各試驗組黑水虻幼蟲淋巴體液中溶菌酶活性在前4 d會有較大的提高，其中金黃色葡萄球菌(ATCC43300)試驗組溶菌酶活性的提高效果最為明顯，沙門氏菌(ATCC14028)試驗組其次，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)試驗組隨后，但對照組溶菌酶活性提升不明顯；第6天各試驗組黑水虻幼蟲體內溶菌酶活性比第4天低，根據前述病原菌飼料的試驗結果，此時大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)試驗組和沙門氏菌(ATCC14028)組中病原菌已經降低到檢測極限以下，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)組中病原菌數量也下降到了較低的水平；第2次添加病原菌飼料之后，環境中的病原菌數量增加，第8天各試驗組黑水虻幼蟲體內溶菌酶活性對比第6天均有提高，到達峰值且溶菌酶活性要高于第4天,第10天由于大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)試驗組和沙門氏菌(ATCC14028)試驗組中病原菌數量降低到檢測極限以下，各試驗組黑水虻幼蟲體內溶菌酶活性均有降低，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)試驗組和沙門氏菌(ATCC14028)試驗組達到對照組相似的水平，金黃色葡萄(ATCC43300)球菌組仍高于對照組，第12天各試驗組和對照組黑水虻幼蟲體內溶菌酶活性與第10天相比沒有顯著性差別(p>0.05)。

根據以上結果可知，黑水虻幼蟲體內溶菌酶的活性變化與環境內的病原菌數量相關，病原菌數量增加時，黑水虻幼蟲體內溶菌酶的活性也隨之提高，病原菌數量降低時，黑水虻幼蟲體內溶菌酶活性也會降低。因此，將第0天的各組病原菌數量對應第2天的各組溶菌酶活性，以此類推，利用CORREL函數計算出病原菌數量與黑水虻幼蟲體內溶菌酶活性的相關系數r，見表2。

表2 病原菌數量與溶菌酶活性的相關系數

由表2可知，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)組和沙門氏菌(ATCC14028)組的病原菌數量與溶菌酶活性存在中度正相關關系(0.50.8)。

3 討 論

在人為富集單一病原菌并制成病原菌飼料喂食給3日齡黑水虻幼蟲的試驗條件下，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)濃度在4～6 d的處理時間內會降到平板計數法的檢測極限以下(10 CFU/g)，這個檢測極限較低，幾乎可以認為大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)被完全清除，而金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的存活數量高于檢測極限，沒有被完全清除，導致這種差異的可能原因是金黃色葡萄球菌(ATCC43300)為革蘭氏陽性菌(G+)，其抗逆性比大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)這兩種革蘭氏陰性菌(G-)強，黑水虻幼蟲對其的殺滅能力有限，同時這也可能與昆蟲應對G+和G-的免疫途徑不同有關[22]。第二次添加病原菌飼料之后，病原菌接種的濃度與第一次接種處于相似水平，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)被完全清除所需要的時間均減少了2 d，此時試驗環境沒有較大的改變，主要變量在于黑水虻幼蟲的日齡，這說明日齡較大的黑水虻幼蟲殺滅病原菌的能力更強，而溶菌酶活性檢測試驗中日齡大的黑水虻幼蟲體內的溶菌酶活性峰值要大于日齡小的黑水虻幼蟲，這與上述現象相符合。

在雞糞喂食黑水虻幼蟲試驗中，雞糞中的病原菌數量變化與病原菌飼料試驗的結果類似，試驗組在有黑水虻幼蟲處理的情況下，作為數量指標的基因拷貝數對比對照組下降速度更快，不同的是，在病原菌飼料喂食試驗中，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)作為革蘭氏陽性菌在整個18 d的試驗周期內，并不能被完全清除，而在雞糞喂食試驗中，其相關的sec基因拷貝數在第12天就降低到芯片能檢測到的極限以下。由于兩組喂食試驗的環境條件相似，以上現象可能是兩個喂食試驗存在的差異所致，即檢測技術和飼料基質的不同。檢測技術方面，平板計數法要求樣品中的病原菌必須處于可培養的存活狀態，病原菌生長狀態受到培養條件的影響較大，因此單菌落的計數結果不能反映病原菌存活的準確數量，但僅比較各個樣品間病原菌數量的多少，以及判斷病原菌是否被完全清除這兩個方面則相對可靠。高通量病原菌芯片檢測法以qPCR為基本技術，通過檢測相關基因的絕對拷貝數能夠從側面反映病原菌的存活數量，但此方法也存在一定的缺陷，即病原菌被殺滅后，其包含的相關基因不會立刻降解而是存在延時性，這會對病原菌存活的計數結果產生一定的干擾，而暴露在腸道環境下的DNA容易變性或者被水解吸收，不能長時間保持完整性，所以該干擾對各種病原菌被完全清除所用時間的結果影響較小。由于將一部分死菌也計入數量指標，高通量病原菌芯片檢測法在說明病原菌是否被完全清除方面比平板計數法更為靈敏。在雞糞喂食黑水虻幼蟲試驗中使用更為靈敏的檢測技術發現，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)被完全清除，說明以上現象不是檢測技術產生的誤差所致，更可能是飼養基質的不同導致的差別。兩種飼料基質最大的區別在于其中的微生物群落多樣性，雞糞中的微生物群落組成遠比含單一菌液的飼料復雜，其中優勢菌群的生長會對非優勢菌群的數量產生影響，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)可能并非雞糞中的絕對優勢菌群，其本身的繁殖生長到某個階段會受到其他微生物的抑制，在黑水虻幼蟲協同處理后便會被完全清除。

檢測黑水虻幼蟲體內病原菌時發現，黑水虻幼蟲在停止攝取病原菌并進行饑餓處理后，腸道內部檢測不到大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)，第6天的黑水虻幼蟲體內能檢測到金黃色葡萄球菌(ATCC43300)，而第12天的黑水虻幼蟲體內檢測不到金黃色葡萄球菌(ATCC43300)，其原因可能是金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的抗逆能力強，能在黑水虻幼蟲體內存在較長時間，而當黑水虻幼蟲生長之后殺菌能力提升，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)在體內就會被完全清除，這說明黑水虻幼蟲在具有殺菌能力的同時，自身不會被這3種病原菌所感染，是一種較為安全的昆蟲資源。

黑水虻幼蟲體內的溶菌酶活性試驗結果發現，溶菌酶的活性是伴隨著病原菌數量的變化而變化的，病原菌數量處于較高水平時，溶菌酶活性會增加，病原菌數量處于低水平乃至被完全清除時，試驗組溶菌酶活性會降到沒有病原菌脅迫的對照組水平，通過病原菌數量與溶菌酶活性的相關系數也能發現兩者呈現顯著的正相關關系，而溶菌酶本身作為一種廣譜的抑菌活性物質，其能通過催化細菌細胞壁肽聚糖的水解達到殺滅細菌的效果[23]，因此可以推測溶菌酶參與了黑水虻幼蟲殺滅病原菌的過程，但需要后續的提純和體外試驗進行驗證。

除去上述提到的雞糞中的微生物群落和溶菌酶參與了黑水虻殺滅病原菌的機制，黑水虻腸道內的微生物菌群同樣可能參與了殺滅病原菌的機制。如江承亮[24]的研究發現，黑水虻幼蟲處理含各種細菌的餐廚垃圾堆體時，其腸道內的部分菌群會定殖于堆體之中，這種堆體雖然有著更強的外界抵抗力，但是堆體的細菌群落多樣性會降低，推測是黑水虻幼蟲腸道內的微生物入侵所致，同時黑水虻幼蟲腸道中的菌體群落也會受到堆體中菌群的影響。本研究雖然采用了與上述研究不同的飼料基質，但是飼料中病原菌被完全清除造成飼養環境中微生物群落多樣性降低這一現象與上述研究相符，因而可能具有相同的滅菌機制。

4 結 論

(1) 通過兩種喂養黑水虻幼蟲的試驗發現，黑水虻幼蟲對于大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)、沙門氏菌(ATCC14028)、金黃色葡萄球菌(ATCC43300)均具有一定的殺滅能力。在單一病原菌飼料飼養條件下，3日齡黑水虻幼蟲在4～6 d的處理時間內就能將大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)完全清除，并將金黃色葡萄球菌(ATCC43300)濃度降低到非常低的水平，抑制率在 99%以上，9日齡黑水虻幼蟲則僅需要2～4 d的處理時間就能達到類似的殺菌效果，說明日齡大的黑水虻幼蟲殺菌能力更強；在雞糞飼養條件下，黑水虻幼蟲在8 d的處理時間內就能完全清除大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)，12 d的處理時間內能完全清除金黃色葡萄球菌(ATCC43300)。

(2) 黑水虻幼蟲攝取病原菌一段時間后停止進食，腸道內的3種病原菌會被逐漸殺滅，自身不會受到病原菌的感染。

(3) 黑水虻幼蟲體內的溶菌酶活性與病原菌數量呈顯著的正相關關系，根據溶菌酶自身的功能，推測溶菌酶參與了黑水虻幼蟲殺滅病原菌的過程。