基于非靶向代謝組學鑒別釀造白酒與勾兌酒

◎ 包塔娜，楊 洋，王柏輝

（鄂爾多斯市檢驗檢測中心，內蒙古 鄂爾多斯 017000）

我國傳統工藝釀造的白酒，歷史悠久、香型眾多、口味各異。清香型白酒因其口感清香純正、口味柔和、余味凈爽等風味特征受到消費者青睞。伴隨著精密分析儀器的發展，色譜、光譜、質譜等技術已被廣泛應用于白酒風味物質、香型、年份酒以及真假酒的鑒別中[1]。卓俊納等[2]利用電感耦合等離子體質譜法技術結合化學計量學鑒別不同品牌醬香型白酒，研究表明，Na、Ca、Al、K 等元素是造成不同品牌醬香型白酒差異性的主要無機元素。莫新良等[3]基于頂空固相微萃取結合氣質聯用技術對不同甜香風味特征醬香型白酒揮發性風味物質進行剖析，共鑒定出68 種風味物質，包括酯類27 種、醇類12 種、醛酮類10 種、酸類3 種、芳香族化合物10 種和萜烯類物質6 種。卓俊納等[4]基于氣相色譜-四極桿飛行時間質譜法結合化學計量學建立3 種白酒（濃香型、醬香型和清香型）的3 種判別模型，研究表明偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）模型的區分效果最好，同時指出己酸乙酯、乳酸乙酯等9 種物質是區分不同香型白酒風味差異的主要物質。CAJKA 等[5]基于高分辨質譜和實時檢測技術分析啤酒中揮發性風味物質，再利用偏最小二乘判別分析法建立判別模型，該模型的鑒別準確度能達到100%，該判別模型對于啤酒產品的真偽鑒別具有較高的參考價值。

非靶向代謝組學技術是以無偏向的方式分析尋找盡可能多的組分，再通過統計學方法尋找能夠反映組間差異的特征化合物，從而對不同個體之間的差異作出判別，已被廣泛應用于食品成分分析、食品摻假鑒定、品質鑒別以及食品產地溯源等方面。JIANG等[6]利用代謝組學技術分析了不同品種荔枝果肉中多酚類代謝物的差異，試驗結果表明，共鑒定出8 類126 種多酚代謝物，并推斷出荔枝果肉中主要多酚代謝產物為黃酮類、黃酮醇類、羥基肉桂酰類和兒茶素類。YE 等[7]基于非靶向代謝組學技術分析不同地區綠茶中揮發性風味物質，結合主成分分析對綠茶產地進行鑒別。結果表明，不同產地來源的綠茶中揮發性物質的含量差異顯著，可建立用于綠茶產地溯源的方法。DE-FLAVIIS 等[8]采用非靶向代謝組學技術對6 個地區小麥風味品質進行檢測研究，共得到158 種揮發性風味成分，通過化學計量學方法對不同產地的小麥進行分類，篩選出各產地最具特征性的揮發性風味成分，為探索產地區域對小麥風味品質的影響提供了理論依據。

本文利用超高效液相色譜-飛行時間質譜技術探究釀造白酒和勾兌酒的特征標記物質，結合化學計量學建立OPLS-DA 判別模型，可為白酒鑒別和品質評定提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市場采購3 種釀造白酒（編號為BL1、BL2和BL3）和3 種勾兌酒（編號LFL1、LFL2和LFL3）。

甲酸（質譜純）、甲醇、甲酸銨（色譜純），美國Fisher 公司。

1.2 儀器與設備

Exion 20AD 型超高效液相色譜儀和Xevo G2-XS型高分辨四極桿飛行時間串聯液質聯用儀（美國Waters 公司）；Sorvall Legend Micro 17R 型離心機（美國賽默飛有限公司）；艾科普超純水機A3S-05-05-CE（美國Millipore 公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

6 個白酒樣品分別取5 mL，在3 000 g、25 ℃條件離心10 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，收集過濾后樣品于進樣瓶中，4 ℃保存待測。

1.3.2 色譜條件

Waters T3 液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A- 水（含0.1% 甲酸）、B- 乙 腈（含0.1% 甲 酸）；流 速：0.35 mL·min-1；進樣體積：2 μL。梯度洗脫：0 ～2.5 min，95% A；2.5 ～4.0 min，70% A；4.0 ～9.0 min，50% A；9.0 ～11.0 min，20% A；11.0 ～14.0 min，0% A；14.0 ～15.0 min，0% A；15.0 ～15.1 min，95% A；15.1 ～16.0 min，95% A。

1.3.3 質譜條件

離子源：ESI；電離模式：正離子模式；氣體溫度：320 ℃；保護氣溫度：350 ℃；干燥器流速：7.5 L·min-1；保護氣流速：12 L·min-1；噴霧氣壓：35 psi（145 psi=1×106Pa）；離子源毛細管電壓：4 000 V；噴嘴壓力：1 000 V；MS-TOF 毛細管電壓：175 V；一級質譜質量掃描范圍（m/z）：100 ～3 000。

1.4 數據處理

下機數據通過Abf Converter 軟件轉換為.ABF 數據格式，再利用MS-DIAL 軟件進行峰檢測和識別、反卷積、定性分析等一系列處理，然后基于HMDA 和MASS BANK 數據庫對所檢測到物質進行定性分析，并進行歸一化處理得到數據。通過SIMCA 軟件分析數據，以OPLS-DA 模型第一主成分的VIP值＞1，T檢驗返回的P值＜0.05 為標準，篩選釀造白酒和勾兌酒的差異代謝物，并計算出兩組間差異代謝物的變化倍數（Fold Change，FC），即勾兌酒與釀造白酒中差異代謝物的比值。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 OPLS-DA 分析

非靶向代謝組學分析得到大量的多維數據，為探究數據中存在的潛在規律，需要借助一系列的多元統計分析方法進行降維處理和分析。本實驗采用SIMCA軟件對所有白酒樣本進行有監督OPLS-DA 分析。由圖1 可知，釀造白酒和勾兌酒能較好的區分開，各組聚類趨勢較為明顯。

圖1 白酒樣本的OPLS-DA 分析圖

2.2 發酵酒與勾兌酒代謝物差異分析

由表1 可知，兩種類型的白酒中化合物含量表達差異明顯，可作為區別其他類型白酒的重要標志物。本文白酒樣品中共鑒定到46 種風味化合物，最終鑒定到釀造白酒與勾兌酒間的差異代謝物共15 種。其中，6 種化合物（FC值＞1）是勾兌酒的標記物，9 種化合物（FC值＜1）是釀造白酒的標記物。次黃嘌呤（Hypoxanthine）在勾兌酒中表達差異明顯，4-甲基戊酸（4-Methylvaleric acid）和羥基丁二酸（Hydroxysuberic acid）在釀造白酒中表達差異明顯，可分別作為兩種白酒的鑒定標志物。

表1 釀造白酒與勾兌酒的代謝物差異分析表

3 結論

本論文基于非靶向代謝組學技術對釀造白酒和勾兌酒的風味化合物進行篩查分析，利用組學思維對兩種類型的白酒進行鑒別分析。白酒樣品中總共鑒定出46 種風味化合物，兩種類型白酒中差異化合物15種。其中，釀造白酒中4-甲基戊酸和羥基丁二酸為主要標識物；而勾兌酒中次黃嘌呤為主要標識物。通過OPLS-DA 分析能夠很好地區分釀造白酒和勾兌酒。因此，依據不同酒型的風味特征，綜合應用代謝組學技術結合化學計量學方法，建立標準化白酒產品真實性鑒別平臺是檢測機構的研究發展方向。