HPLC法測定唇香草中迷迭香酸與蘆丁的含量

毛麗旦·阿扎提，王 瑩，蘭 衛,*

(1.新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆醫科大學附屬中醫醫院藥學部，新疆 烏魯木齊 830002)

唇香草(ZiziphoraclinopodioidesLam.)又名新塔花，為新疆特色植物，具有多種生物活性。郭玉婷等[1]研究了唇香草揮發油對自發性高血壓大鼠(SHR)的降壓作用，發現唇香草揮發油對SHR具有顯著的降壓作用。姜君君等[2]研究了維藥唇香草乙醇提取物的抗氧化活性，發現唇香草乙醇提取物具有較好的抗氧化活性，可作為一種天然抗氧化劑來開發利用。

唇香草的主要有效成分有胡薄荷酮、迷迭香酸、蘆丁等[3-4]。其中，迷迭香酸是一種酚酸類化合物，具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗血栓、抗花生四烯酸代謝及增強纖溶性[7]等藥理作用；蘆丁是一種黃酮類化合物，具有降血壓、消炎抑菌、抗氧化等藥理作用，測定這兩種活性成分含量對唇香草進行質量控制具有重要意義。鑒于此，作者采用HPLC法測定唇香草中迷迭香酸與蘆丁的含量。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

唇香草，2015年4月采集于烏魯木齊南山小渠子中醫學院藥材種植基地，經新疆醫科大學盛萍教授鑒定為唇形科塔花族屬唇香草(ZiziphoraclinopodioidesLam.)的上部干燥部分。

蘆丁對照品(批號HQ105561198，純度98%)、迷迭香酸對照品(批號20283-92-5，純度98%)，寶雞辰光生物科技有限公司。

Agilent 1200-DAD型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 對照溶液的制備

精密稱取迷迭香酸對照品2.90 mg、蘆丁對照品1.03 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得0.116 mg·mL-1迷迭香酸對照溶液、0.041 2 mg·mL-1蘆丁對照溶液。

1.3 供試溶液的制備

稱取1.0 g唇香草藥材，置于帶塞錐形瓶中，加入10 mL甲醇，稱重；100 Hz下超聲提取40 min，放冷，用甲醇補足重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)，迷迭香酸：流動相為甲醇-1.5%乙酸(40∶60，體積比，下同)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長330 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL；蘆丁：流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫程序：0～9 min，17%～20%(A)；9～20 min,20%～32%(A)；20～40 min,32%～60%(A)；40～45 min,60%～17%(A)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長354 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

在該色譜條件下唇香草中迷迭香酸和蘆丁與其它組分離較好(圖1)，分離度均大于1.5，理論塔板數均大于3 000。

圖1 對照溶液(a、b)、供試溶液(c、d)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of control solution(a,b) and test solution(c,d)

2 結果與討論

2.1 線性關系

分別精密吸取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL迷迭香酸和蘆丁對照溶液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得迷迭香酸濃度(mg·mL-1)分別為0.011 6、0.023 2、0.034 8、0.046 4、0.058 0溶液，蘆丁濃度(mg·mL-1)分別為0.004 1、0.008 2、0.012 4、0.016 5、0.020 6溶液，按1.4色譜條件進樣測定，得迷迭香酸峰面積分別為40.5、88.2、136.1、187.4、235.1；蘆丁峰面積分別為17.5、35.9、52.4、71.6、85.7。以標準溶液濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，擬合得迷迭香酸回歸方程：y=4210.30x-9.06，R=0.9999；蘆丁回歸方程：y=4177.2x+0.9900，R=0.9991。迷迭香酸與蘆丁濃度分別在0.011 6～0.058 0 mg·mL-1、0.004 1～0.020 6 mg·mL-1范圍內與峰面積線性關系良好。

2.2 精密度

精密吸取0.116 mg·mL-1迷迭香酸對照溶液、0.041 2 mg·mL-1蘆丁對照溶液各6份，按1.4色譜條件連續進樣測定6次。測得迷迭香酸峰面積分別為382.6、366.1、372.2、382.9、365.4、378.9，平均峰面積為374.68，RSD值為2.11%；蘆丁峰面積分別為119.7、118.3、121.4、124.6、123.9、122.6，平均峰面積為121.75，RSD值為2.00%。表明儀器精密度良好。

2.3 重復性

取6份唇香草藥材，按1.3方法制備供試溶液，按1.4色譜條件進樣測定。測得迷迭香酸峰面積分別為72.3、74.9、72.5、72.4、70.5、73.8，平均峰面積為72.73，RSD值為2.05%；蘆丁峰面積分別為30.1、29.6、29.5、29.8、31.0、30.4，平均峰面積為30.10，RSD值為1.90%。表明該方法重復性良好。

2.4 穩定性

按1.3方法制備供試溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h按1.4色譜條件進樣測定。測得迷迭香酸峰面積分別為74.6、72.5、73.8、71.5、74.6、71.5，平均峰面積為73.68，RSD值為1.91%；蘆丁峰面積分別為30.1、28.9、29.0、30.3、29.7、29.5，平均峰面積為29.60，RSD值為1.90%。表明唇香草中迷迭香酸與蘆丁成分在10 h內穩定性良好。

2.5 加標回收率

取9份唇香草藥材，每份1.0 g，隨機分成3組，每組3份，分別加入2.7 mL(低濃度組)、3.6 mL(中濃度組)、3.7 mL(高濃度組)迷迭香酸對照溶液；另取唇香草藥材9份，同法分為3組，分別加入1.7 mL(低濃度組)、3.4 mL(中濃度組)、3.6 mL(高濃度組)蘆丁對照溶液，按1.3方法制備供試溶液，按1.4色譜條件進樣測定，結果分別見表1、2。

由表1、表2可知，迷迭香酸高、中、低濃度組的平均加標回收率分別為100.55%、99.12%、101.38%，RSD值分別為1.49%、1.81%、2.10%；蘆丁高、中、低濃度組的平均加標回收率分別為100.00%、101.43%、101.90%，RSD值分別為3.60%、2.54%、2.92%。

表1 迷迭香酸的加標回收率(n=9)Tab.1 Recoveries of rosmarinic acid(n=9)

表2 蘆丁的加標回收率(n=9)Tab.2 Recoveries of rutin(n=9)

2.6 唇香草中迷迭香酸與蘆丁的含量測定

取3份供試溶液，按1.4色譜條件進樣測定3次，測得迷迭香酸峰面積分別為77.81、79.27、78.55、79.70、79.92、80.21、80.65、80.88、81.02，平均峰面積為79.80，唇香草中迷迭香酸含量為0.209 mg·g-1；蘆丁峰面積分別為30.81、30.76、30.44、29.95、29.56、29.30、29.10、28.99、28.75，平均峰面積為29.74，唇香草中蘆丁含量為0.140 mg·g-1。

2.7 討論

平崇等[8]采用HPLC法測定了腎石消膠囊中迷迭香酸的含量，流動相為甲醇-0.1%三氯乙酸(40∶60)，檢測波長330 nm，但作者發現該色譜條件下唇香草中迷迭香酸所對應位置未出峰。吳桂凡等[9]采用HPLC法測定了溪黃草中迷迭香酸的含量，流動相為乙腈-0.4%磷酸(梯度洗脫)，檢測波長327 nm。王清等[10]以乙腈-0.1%磷酸(25∶75)為流動相，測定了溪黃草中迷迭香酸的含量。李明等[11]以甲醇-1.5%乙酸(38∶62)為流動相，測定了牛至中迷迭香酸的含量。作者在測定唇香草中迷迭香酸含量時，選擇甲醇-1.5%乙酸為流動相，并調整流動相比例，所得HPLC圖譜達標。

何媛媛等[12]采用UPLC法測定了意大利牛舌草中蘆丁含量，檢測波長366 nm，柱溫30 ℃，流動相為甲醇(A)-0.4%甲酸(B)，洗脫程序：10～12 min，37%～40%A，蘆丁的保留時間為11．475 min。趙端瑋等[13]采用HPLC法測定了藏藥材蕁麻中蘆丁含量，檢測波長340 nm，流動相為甲醇-0.4%磷酸，梯度洗脫：12～22 min，甲醇-0.4%磷酸(45∶55)。李瑞玲等[14]采用HPLC法測定了不同產地魚腥草中不同部位蘆丁含量，檢測波長358 nm，流動相為甲醇0.1%磷酸，梯度洗脫：10～15 min，甲醇-0.1%磷酸(55∶45)；20 min，甲醇-0.1%磷酸(95∶5)。肖作奇等[15]采用HPLC法測定了地膚子中蘆丁含量，流動相為乙腈-0.2%磷酸。作者選用乙腈-0.2%磷酸為流動相，梯度洗脫，唇香草中蘆丁的出峰時間與對照品一致，但峰形不理想，通過調整流動相比例使得HPLC圖譜達標。

3 結論

建立了測定唇香草中迷迭香酸和蘆丁含量的HPLC方法。結果表明，迷迭香酸、蘆丁與其它成分分離良好，分別在0.011 6～0.058 0 mg·mL-1(R=0.9999)、0.004 1～0.020 6 mg·mL-1(R=0.9991)濃度范圍內與峰面積線性關系良好；唇香草中迷迭香酸、蘆丁含量分別為0.209 mg·g-1、0.140 mg·g-1。該方法簡便、準確，適用于唇香草中迷迭香酸與蘆丁的含量測定。