牛蒡子中牛蒡苷元納米載藥體系的研究

劉斯文，史 銳，劉苗苗，叢龍嬌，黃曉彤

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 110000)

近年來，惡性腫瘤是導致人類死亡的主要原因,是嚴重威脅人類生命健康的主要疾病之一[1]。目前,中藥以多靶點、低毒性等優點在抗腫瘤方面發揮了重要作用[2]。但中藥的溶解性、生物利用度低等問題亟待解決。納米載藥系統因具有緩控釋[3-4]、靶向性[5-6]、提高生物利用度[7]、降低藥物毒副作用[8]、避免蛋白類藥物降解[9]、能夠高選擇性地到達癌細胞并作用于癌細胞內外的小分子或基因物質等優點,顯示了強大的抗癌作用[10]。

中藥牛蒡子具有抗炎[11-12]、抑制腫瘤細胞[13-14]、抑菌[15]、抗病毒[16]等作用。牛蒡苷元(arctigenin，ARG)是牛蒡子的主要活性成分之一[17]，在抗炎、抗病毒、降血糖、擴張血管及免疫調節等方面具有獨特的藥理作用。Chae等[18]研究發現，木脂素類化合物中牛蒡苷元的抗炎作用最明顯。Awale等[19]研究發現，牛蒡子的二氯甲烷提取物(50 μg·mL-1)對營養缺乏的癌細胞具有細胞毒性，其顯示毒性的濃度為0.01 g·mL-1，對裸鼠胰腺癌細胞株(PANC-1)生長具有顯著的抑制作用。Hausott等[20]研究表明，牛蒡苷元可通過誘導結腸直腸癌細胞凋亡，進而起到抑制結腸直腸癌的作用。

基于此，作者對介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles，MSN)進行葉酸(FA)和氧化鋅(ZnO)雙重修飾，制備裝載牛蒡苷元的載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG，通過SEM、TEM、XRD和N2吸附-脫附分析對其進行表征，并對載藥體系的載藥性能和釋藥性能進行評價。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

載藥體系：MSN-ARG、FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG-GSH，自制。

牛蒡苷元標準品，上海同田生物技術有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正硅酸乙酯(TEOS)、二硫蘇糖醇(DTT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、PBS緩沖溶液、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)、無水甲苯、葉酸(FA)、二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、無水乙酸鋅、乙酸鎂四水合物、氫氧化鈉、氨水、谷胱甘肽(GSH)，國藥集團化學試劑有限公司。

SX2-12-12D型馬弗爐，上海和呈儀器制造有限公司；FTIR-650型傅立葉變換紅外光譜儀，廣州科曉科學儀器有限公司；SNE-4500M型掃描電子顯微鏡(SEM)、小角X-射線粉末衍射儀，深圳方特科技有限公司；Tecnai G2型透射電子顯微鏡(TEM)，FEI公司；高性能多通道全自動比表面積及孔隙度分析儀，麥克莫瑞提克(上海)儀器有限公司。

1.2 牛蒡苷元檢測波長的確定及標準曲線的繪制

配制一定濃度的牛蒡苷元甲醇標準溶液，以無水甲醇作空白對照，發現其在249 nm處有最大吸收峰，故選擇249 nm作為檢測波長。

精確稱取6.0 mg牛蒡苷元，加無水甲醇溶解后轉移至25 mL容量瓶中定容，得0.24 mg· mL-1牛蒡苷元標準溶液；分別移取該標準溶液0 mL、0.2 mL、0.6 mL、1.0 mL、1.4 mL、1.8 mL、2.2 mL至10 mL容量瓶中，加無水甲醇定容；以無水甲醇作空白對照，利用紫外分光光度計測定249 nm處吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制牛蒡苷元的標準曲線。

1.3 載藥體系的制備

1.3.1 MSN的制備

以CTAB為模板劑、TEOS為硅源，在堿性條件下與氨水在室溫下攪拌，即得MSN。

1.3.2 MSN的表面修飾

稱取少量MSN，將其分散在含有巰基硅烷偶聯劑MPTS和氨基硅烷偶聯劑APS(1∶1)的無水甲苯中(MSN與偶聯劑總量1∶1混合)，超聲處理，在80 ℃水浴中攪拌12 h，冷卻，產物抽濾，用無水乙醇洗滌2次，60 ℃真空干燥，即得改性產物NH2@SH-MSN。

1.3.3 MSN表面的FA修飾

將100 mg EDC和100 mg NHS溶于DMSO/DMF(體積比1∶3)中，在室溫下攪拌至完全溶解后，加入200 mg FA，繼續攪拌24 h，活化FA的-COOH；再加入適量NH2@SH-MSN，在室溫、避光條件下攪拌12 h，離心分離，即得FA@SH-MSN。

1.3.4 ZnO納米粒子的制備及巰基化修飾

將適量的無水乙酸鋅和乙酸鎂四水合物(10∶1)在劇烈攪拌下溶于60 mL熱無水乙醇中。將0.2 g NaOH溶于20 mL熱無水乙醇中。在冰浴條件下，將NaOH溶液快速滴入含有乙酸鋅和乙酸鎂的乙醇溶液中，并在室溫、避光條件下攪拌至反應完全，得到白色的ZnO納米粒子，紫外燈照射，在365 nm波長下發出黃綠色熒光。以正己烷作為沉淀劑，離心分離ZnO納米粒子。

將制得的ZnO納米粒子溶于DMF中，滴加MPTS(1∶1)，高溫攪拌，離心，用DMF洗滌3次；將顆粒分散于蒸餾水中，得到無色澄清ZnO納米粒子溶液，避光放置，備用。

1.3.5 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的制備

將20 mg FA@SH-MSN分散于含有5 mg DTT的5 mL PBS緩沖溶液(pH=7.4，下同)中，加入500 μL ZnO納米粒子溶液，室溫避光攪拌24 h，離心分離，PBS緩沖溶液洗滌3次，60 ℃真空干燥，即得FA@ZnO-MSN。

精確稱取20 mg牛蒡苷元，溶于15 mL無水乙醇中，加入50 mg FA@SH-MSN，超聲溶解，室溫攪拌24 h，沉淀，離心，用無水乙醇洗去殘留在FA@SH-MSN表面的牛蒡苷元，得到FA@SH-MSN-ARG。將20 mg FA@SH-MSN-ARG分散于含有5 mg DTT的5 mL無水乙醇中，加入500 μL ZnO納米粒子溶液，室溫避光攪拌24 h后，離心分離，并用無水乙醇洗滌幾次，60 ℃真空干燥，得到載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG。按式(1)計算載藥率(%)：

(1)

1.4 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的釋藥性能

分別稱取10 mg載藥體系FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG和FA@ZnO-MSN-ARG-GSH(GSH濃度為2 mmol·L-1)置于透析袋中密封，將其懸浮于500 mL含1%SDS的PBS緩沖溶液(pH=7.4)中，在(37.0±0.5) ℃恒溫搖床中100 r·min-1下進行透析，每隔一段時間取出5 mL PBS緩沖溶液，同時補充相應量的新鮮PBS緩沖溶液，采用紫外分光光度計測定249 nm處吸光度。根據牛蒡苷元的標準曲線方程計算得到緩沖溶液中牛蒡苷元濃度，以累積釋藥量為縱坐標、時間為橫坐標繪制體外釋藥曲線。按式(2)計算釋藥率(%)：

(2)

2 結果與討論

2.1 牛蒡苷元的標準曲線(圖1)

圖1 牛蒡苷元的標準曲線Fig.1 Standard curve of arctigenin

經擬合得線性回歸方程：y=2.2481x-0.0161，R2=0.9992。表明牛蒡苷元濃度在0～0.05 mg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的表征

2.2.1 SEM分析(圖2)

圖2 MSN(a)、FA@ZnO-MSN-ARG(b)的SEM照片Fig.2 SEM images of MSN(a) and FA@ZnO-MSN-ARG(b)

從圖2可知，未經修飾的MSN的均勻性相對較好，粒徑約為100 nm，形態幾乎為球形(圖2a)；經修飾、載藥后，FA@ZnO-MSN-ARG納米顆粒的均勻性也相對較好，粒徑增大至150 nm左右，出現大量橢球形顆粒，表面略粗糙(圖2b)。

2.2.2 TEM分析(圖3)

圖3 FA@ZnO-MSN(a)、FA@ZnO-MSN-ARG(b)的TEM照片Fig.3 TEM images of FA@ZnO-MSN(a) and FA@ZnO-MSN-ARG(b)

從圖3可知，載藥前，FA@ZnO-MSN納米顆粒中存在大量相對有序的通孔(圖3a)；載藥后，FA@ZnO-MSN-ARG納米顆粒中有序貫穿孔道變少，甚至幾乎不可見(圖3b)。這是因為，在載藥體系的制備過程中大量牛蒡苷元吸附到MSN的孔中，且ZnO納米粒子作為分子開關也堵在MSN的孔口。

2.2.3 XRD分析(圖4)

從圖4可知，FA@ZnO-MSN-ARG納米顆粒在2θ為2.5°左右有一個較強的衍射峰，該峰對應于(100)晶面，是六方結構介孔材料最主要的特征峰，該衍射峰較強，表明制備的材料有序度較高，結構比較穩定，骨架沒有崩塌，說明MSN經修飾和載藥后依然能夠保持較高的結晶性；與未經修飾的MSN相比，FA@ZnO-MSN-ARG納米顆粒在2θ為4°～5°之間的(100)和(200)衍射峰削弱了很多，說明MSN的修飾和載藥效果已經達成，且沒有破壞整體結構，仍然具有MSN納米介孔材料結構的特征。

圖4 FA@ZnO-MSN-ARG的XRD圖譜Fig.4 XRD pattern of FA@ZnO-MSN-ARG

2.2.4 N2吸附-脫附曲線(圖5)

圖5 FA@ZnO-MSN-ARG的N2吸附-脫附曲線(a)和孔徑分布曲線(b)Fig.5 N2 adsorption-desorption curve(a) and pore size distribution curve(b) of FA@ZnO-MSN-ARG

從圖5a可知，FA@ZnO-MSN-ARG的BET比表面積為104.98 m2·g-1，其比表面積相對載藥前降幅較大。此外還可以觀察到，FA@ZnO-MSN-ARG的N2吸附-脫附曲線為Ⅳ型，具有介孔材料的吸附-脫附曲線特征，載藥后的結構仍然比較穩定，整體結構沒有被破壞。從圖5b可知，經修飾、載藥后，FA@ZnO-MSN-ARG的孔徑分布較窄，主要在1.93～2.56 nm之間，平均孔徑為1.96 nm。

2.3 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的載藥性能

分2組檢測(即牛蒡苷元與載體比例R為0.5和1.0)3個載藥體系MSN-ARG、FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG的載藥率和包封率，結果見表1。

從表1可知，隨著牛蒡苷元與載體比例的增加，載藥體系MSN-ARG、FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG的載藥率升高，其中FA@ZnO-MSN-ARG的載藥率最高；但隨著牛蒡苷元與載體比例的增加，載藥體系MSN-ARG、FA-MSN-ARG的包封率下降，FA@ZnO-MSN-ARG的包封率升高。

表1 不同載藥體系的載藥率和包封率Tab.1 Drug loading ratio and encapsulation efficiency of different drug delivery systems

2.4 載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的釋藥性能(圖6)

圖6 FA-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG、FA@ZnO-MSN-ARG-GSH在pH值7.4下的體外釋藥曲線Fig.6 In vitro drug release curves of FA-MSN-ARG,FA@ZnO-MSN-ARG,and FA@ZnO-MSN-ARG-GSH at pH value of 7.4

從圖6可知，載藥體系FA-MSN-ARG因為沒有封堵，釋藥速率較快，在0～16 h釋藥率達到48.30%；而后釋藥率緩慢升高，在24 h達到最高，為50.50%，具有一定的緩釋作用，但考慮到藥物在傳遞過程中釋放的損耗，真實作用于腫瘤細胞的藥物含量會大大降低。載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG在0～6 h釋藥速率較快，釋藥率達到16.92%；在36 h時釋藥率達到最高，僅為19.05%，而后保持不變。模擬載藥體系進入細胞內釋藥情況，在載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG中加入GSH，發現牛蒡苷元的釋藥率明顯升高，在12 h內釋藥速率較快，較載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG明顯加快，在36 h時釋藥率達到最高，為39.25%。

3 結論

通過溶膠-凝膠法成功制備了裝載牛蒡苷元的納米載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG，隨著牛蒡苷元與載體比例的增加，載藥體系MSN-ARG和FA-MSN-ARG的載藥率升高、包封率降低，載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG的載藥率和包封率遠高于MSN-ARG、FA-MSN-ARG；在載藥體系FA@ZnO-MSN-ARG中加入谷胱甘肽(GSH)，牛蒡苷元的釋藥率明顯升高，在12 h內釋藥速率較快，在36 h時釋藥率達到最高，為39.25%。該載藥體系具有緩釋、控釋效果，為牛蒡子的進一步開發利用提供了理論依據。