游離亞硝酸對亞硝酸鹽氧化菌活性的抑制作用機制

楊昕怡，常煥煥，于 雪，李曉強，王光杰，孫洪偉,*

(1.蘭州交通大學環境與市政工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.煙臺大學環境與材料工程學院，山東 煙臺 264000；3.山東同濟測試科技股份有限公司，山東 煙臺 264000)

硝化反應包括亞硝化和硝化兩步反應，第一步：氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)將氨氮氧化成亞硝酸鹽；第二步：亞硝酸鹽氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)將亞硝化反應生成的亞硝酸鹽進一步氧化為硝酸鹽。AOB和NOB屬于典型的化能自養菌，銨鹽和亞硝酸鹽[1-3]通過這兩種細菌的作用最終轉化為硝酸鹽。雖然NOB從氧化亞硝酸鹽這一過程中獲得生命活動需要的能量，但是大多NOB對周圍環境中亞硝酸鹽濃度的高低非常敏感[2,4]，并不是亞硝酸鹽濃度越高越好。

硝化反應過程中，FNA是NOB的基質底物，又是一種NOB活性抑制劑。當FNA濃度較低時，能夠加快亞硝酸鹽的氧化反應，但同時基于底物抑制動力學，當FNA濃度較高時，又會對NOB活性產生抑制作用。因此，硝化反應過程中真正的抑制劑是FNA[8-10]。孫洪偉等[11]研究發現，FNA對NOB活性具有顯著抑制影響，該抑制影響可通過基質抑制動力學模型描述，且具有明顯的分段現象。當0.004 mg·L-1≤FNA≤0.178 mg·L-1，隨著FNA濃度增加，NOB活性逐漸增強，表明該濃度條件下，FNA會提高NOB活性；當0.191 mg·L-1≤FNA≤0.702 mg·L-1時，NOB活性隨著FNA濃度的增加呈降低趨勢，表明該濃度條件下，FNA可能抑制了NOB的活性；當FNA>0.702 mg·L-1時，NOB幾乎沒有活性，表明NOB活性被完全抑制。

目前，尚未有基于富集NOB的SBR系統中開展FNA對NOB的抑制動力學及亞硝酸鹽氧化功能基因的相關研究。作者以長期富集的NOB菌屬為研究對象，通過動力學模型探究不同pH 值(6.5、7.0、8.0)條件下，FNA對NOB菌屬活性的抑制動力學影響，篩選能夠準確描述該抑制影響的動力學模型，并結合熒光定量PCR技術，考察不同pH值條件下亞硝酸鹽氧化還原酶基因(nxrA和nxrB)的變化規律，從生化反應動力學和統計學兩方面闡述FNA對NOB活性的抑制機制。

1 實驗

1.1 實驗用水及接種污泥

接種污泥，取自蘭州市某污水處理廠氧化溝工藝的活性污泥，具有良好的生物脫氮性能和硝化功能，其混合液揮發性懸浮固體濃度(MLVSS)為830 mg·L-1。

1.2 方案

1.3 熒光定量PCR技術

絕對定量PCR(absolute quantification PCR，AQ-PCR)技術是先繪制標準曲線(由拷貝數已知的標準品測出)，然后測定未知樣品的閾值循環(Ct)值，最后根據標準曲線推出該樣品的起始濃度，以達到絕對定量樣品基因mRNA、DNA 分子拷貝數的目的。樣品在測定過程中，需要同時對未知樣品和標準品進行PCR循環，未知樣品cDNA 的起始拷貝數是通過將未知樣品的Ct值與標準曲線結合起來而得出。把PCR 擴增過程中擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數定義為Ct值，其具有重現性。質粒DNA、RNA和ssDNA都可以作為測定過程中的標準品使用。實驗中檢測的功能基因和PCR引物信息[13]見表1。

表1 功能基因和PCR引物信息Tab.1 Information of functional gene and PCR primer

按式(1)計算拷貝數(X0)：

Ct=-KlogX0+b

(1)

式中：K為標準曲線斜率；b為標準曲線截距。

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1.4 基質抑制動力學模型

(1)Haldane模型[14]

1930年，Haldane發現在生化反應過程中，基質底物和催化作用的酶會形成酶-底物的中間復合物，該中間復合物會對酶產生較強的抑制作用，建立了Haldane模型(式2)來描述這種抑制影響。

(2)

(2)Aiba模型[15]

1968年，Aiba等發現酒精的發酵產物能夠顯著抑制微生物的生化反應過程，建立了產物抑制模型(式3)。

(3)

(3)Edwards模型[16]

1970年，Edwards建立了基質抑制動力學模型(式4)，該模型被廣泛應用于描述硝化反應過程中基質底物對微生物活性的抑制作用。

(4)

(4)Luong模型[17]

1987年，Luong建立了用于描述基質底物濃度對微生物增殖過程的影響的動力學模型(式5)。

(5)

上述式中：S為底物濃度，mg·L-1；r為底物的比降解速率，d-1；rmax為微生物最大比降解速率，d-1；KS為半飽和常數，mg·L-1；KI為抑制常數，mg·L-1；P為產物濃度，mg·L-1。

2 結果與討論

2.1 NOB富集系統內活性污泥微生物菌群特性

NOB富集系統屬水平的微生物群落組成結構(3個平行樣品)如圖1所示。

圖1 NOB富集系統屬水平微生物群落組成結構Fig.1 Microbial community composition at genus level in NOB enrichment system

2.2 FNA對NOB活性的抑制動力學

為了探究FNA對NOB活性的抑制動力學影響，通過批次實驗獲得了不同FNA濃度在3種pH值條件下的比亞硝酸鹽氧化速率(SNiOR)，并采用上述4種基質抑制動力學模型對實驗數據進行擬合，結果如圖2所示。

(a)pH=6.5 (b)pH=7.0 (c)pH=8.0圖2 FNA對NOB活性抑制動力學模型的擬合曲線Fig.2 Fitting curves for kinetic model of inhibition on NOB activity by FNA

從圖2可以看出，在3種pH值條件下，SNiOR的變化規律均適合Haldane模型、Aiba模型和Edwards模型，動力學模型擬合曲線均呈先上升后下降的趨勢。此外，當pH值為6.5時，Luong模型也可以很好地反映FNA對SNiOR的影響。因此，上述4種基質動力學模型均可描述FNA對NOB活性的抑制影響。

在3種pH值條件下，當FNA濃度較低時，即pH=6.5，FNA<0.07 mg·L-1；pH=7.0，FNA<0.21 mg·L-1；pH=8.0，FNA<0.08 mg·L-1，隨著FNA濃度的增加，SNiOR均表現出顯著加快的趨勢，NOB活性顯著增強，也就是說，在較低的FNA濃度范圍內，FNA對NOB的活性具有顯著的促進作用。然而，當FNA濃度高于上述臨界濃度時，隨著FNA濃度的增加，SNiOR卻逐漸減慢，NOB活性逐漸被抑制。因此，FNA對NOB的活性表現出明顯的“低促高抑”的影響規律。

當基質底物為FNA時，采用Haldane模型、Aiba模型和Edwards模型均能較好地描述FNA對NOB活性的抑制影響，但是分析統計參數(RSS、R2、F、P)時發現，Aiba模型的RSS較小，R2較大，F值最大，P值最小。因此，綜合考慮，Aiba模型最適宜描述FNA對NOB活性的抑制影響。

不同pH值條件下，Aiba模型的動力學參數及擬合結果的統計學分析如表2所示。

從表2可以看出，基于Aiba模型獲得的動力學參數rmax具有顯著差異，pH值為8.0 時，rmax最大，為13.63 g N·(g VSS·d)-1， pH值為7.0 時的rmax略高于pH值為6.5的。因此，NOB菌屬在pH值為8.0時具有最高的活性，反應速率最快。對于Aiba模型中KS和KI值，兩者均在pH值為7.0時最大，分別為0.13 mg·L-1和0.63 mg·L-1，顯著高于pH值為8.0、6.5的。說明基質FNA與亞硝酸鹽氧化還原酶的親和力在pH值為7.0時最小，而在pH值為6.5時最大。

表2 不同pH值條件下，Aiba模型的動力學參數及統計學分析Tab.2 Kinetic parameters and statistical analysis ofAiba model under different pH values

2.3 pH值對NOB菌屬亞硝酸鹽氧化還原酶的影響

為了進一步探究在大量富集了NOB的系統內，pH值變化對nxrA、nxrB的影響，對pH值分別為6.5、7.0和8.0條件下的活性污泥進行取樣(每個pH值選3個平行樣)，采用熒光定量PCR技術對nxrA和nxrB基因進行定量，nxrA和nxrB基因的拷貝數如圖3所示。

圖3 不同pH值條件下，nxrA和nxrB基因拷貝數的變化規律Fig.3 Changes of nxrA and nxrB genes copy numbers under different pH values

從圖3可以看出，nxrA和nxrB基因的拷貝數分別介于1.6×109～2.6×109拷貝數/g濕污泥和3.1×107～4.6×107拷貝數/g濕污泥之間，并且nxrB基因的拷貝數比nxrA基因的拷貝數低1～2個數量級。分析原因在于：nxrA屬于Nitrobacter菌群的功能基因[23]，nxrB為Nitrospira菌群的功能基因[24]，即nxrA和nxrB分別是Nitrobacter和Nitrospira的功能基因指示物；本實驗過程中，Nitrobacter是主導活性污泥系統內的最優勢功能菌屬(38.0%)，而Nitrospira的相對豐度較低(0.26%)；此外，pH值的變化會對nxrA和nxrB基因的絕對豐度造成一定的影響，當pH值從6.5增大到7.0時，nxrA和nxrB基因的絕對豐度均表現出逐漸升高的趨勢，而當pH值從7.0增大到8.0時，絕對豐度卻表現出了降低的趨勢。

眾多研究報道了pH值是影響NOB菌屬生物活性的重要因素之一，因為微生物對環境的pH值有一定要求，即有最佳生長環境[25-27]。這種影響的本質應體現在活性污泥中的NOB菌屬內，nxrA和nxrB基因對不同pH值的響應。本實驗發現，pH值能夠顯著影響nxrA和nxrB基因的絕對豐度，進而導致NOB活性的變化。因此，控制適宜的pH 值將有利于生物脫氮系統內亞硝酸鹽的積累[28-29]，使NOB的生物活性維持在較高水平。

3 結論

(1)Nitrobacter是NOB富集系統內豐度最高的菌屬，相對豐度達到38.0%，而NOB的其它菌屬如Nitrospira等硝化菌占比均低于0.5%。

(2)統計學分析結果表明，Haldane、Aiba、Edwards和Luong等4種抑制動力學模型中，Aiba模型最適宜描述FNA對NOB活性的抑制影響，且表現出“低促高抑”的特征。

(3)熒光定量PCR結果顯示，nxrA和nxrB基因的絕對豐度與pH值存在一定關系，且在pH值為7.0時，nxrA和nxrB基因拷貝數最多，分別為2.6×109拷貝數/g濕污泥和4.6×107拷貝數/g濕污泥。此外，在大量富集了NOB的活性污泥系統內，nxrA的絕對豐度高于nxrB，視為主導亞硝酸鹽氧化的功能基因。