非核糖體七肽lipovelutibols A的固相合成

廖秀飛，莫金秋，劉泰容，唐 銘，廖洪利*

(1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500；2.塔里木大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

非核糖體多肽(nonribosomal peptide，NRP)是細(xì)菌和真菌等微生物經(jīng)非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthase,NRPS)催化合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，具有重要的生物活性和藥理特性[2-5]。NRP通常呈環(huán)狀和分支狀結(jié)構(gòu)，含有非天然氨基酸(如D型氨基酸)，NRP合成后會(huì)進(jìn)一步被N-甲基化、N-甲酰基化、糖基化、乙酰化、鹵化和羥基化等修飾以提高其結(jié)構(gòu)或活性的多樣性[3]。因其良好的藥理活性，目前已有超過(guò)20種NRP類藥物上市，如：抗菌藥(青霉素、萬(wàn)古霉素)、抗腫瘤藥(博來(lái)霉素)、免疫抑制劑(環(huán)孢菌素)[4]等。近年來(lái)，隨著惡性腫瘤和多藥耐藥細(xì)菌感染的威脅日益嚴(yán)重，基于NRP開發(fā)新藥來(lái)應(yīng)對(duì)人類重大疾病的研究引起了眾多學(xué)者的關(guān)注[3,5]。

lipopeptaibols是一類由腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌產(chǎn)生的NRP，典型結(jié)構(gòu)特征為：1)分子長(zhǎng)度一般在6～10個(gè)殘基；2)N端有8～15個(gè)碳原子烷基化；3)C端羥基化；4)分子內(nèi)含有較高比例的α，α-二烷基氨基酸，尤其是α-氨基異丁酸(Aib)、異纈氨酸(Iva)、3-乙基正纈氨酸(EtNva)及1-氨基環(huán)丙烷羧酸(Acc)等[6]，這些氨基酸有利于多肽的螺旋化[7]。因其結(jié)構(gòu)的特殊性，相比于一般多肽，lipopeptaibols更容易穿透細(xì)胞膜，發(fā)揮抗菌作用[8]。喜馬拉雅寒冷棲息地存在很多未被發(fā)現(xiàn)的微生物，Singh等[9]從該土壤的木霉屬絲狀變形真菌Trichodermavelutinum中分離得到4個(gè)新型lipopeptaibols，即lipovelutibols A～D，lipovelutibols由7個(gè)氨基酸殘基組成，N端辛酰化，C端為亮氨醇，其結(jié)構(gòu)通式為：octanoyl-Gly-Ala-Leu-Aib/DIva-Ser/Ala-Ile-leucinol。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，lipovelutibols對(duì)人白血病細(xì)胞HL-60、結(jié)腸癌細(xì)胞LS180、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和肺癌細(xì)胞A549等多個(gè)腫瘤細(xì)胞系均可達(dá)到微摩爾級(jí)的抑制毒性，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于lipovelutibols的化學(xué)合成尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。作者采用Fmoc多肽固相合成法合成目標(biāo)產(chǎn)物lipovelutibols A(圖1)，為該類NRP的合成及進(jìn)一步修飾提供研究思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

Fmoc-氨基酸、Wang-Leu-NHFmoc樹脂，上海吉爾生化有限公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、硼氫化鈉(NaBH4)、四氫呋喃(THF)、N-甲基嗎啉(NMM)、2-肟氰乙酸乙酯(ethyl cyanoglyoxylate-2-oxime，Oxyme)、氯甲基異丁酯、三氟乙酸(TFA)、乙腈(色譜純)，北京百靈威科技有限公司；茚三酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無(wú)水乙醚、二氯甲烷(DCM)、哌啶、苯酚均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

氣浴恒溫振蕩器，常州國(guó)宇儀器制造有限公司；LD5-2A型低速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；LC3000型高效液相色譜儀，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；Agilent 1260 Infinity型液相色譜儀、6538UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

lipovelutibols A的合成路線見(jiàn)圖2。

圖2 lipovelutibols A的合成路線Fig.2 Synthetic route of lipovelutibols A

1.2.1 肽鏈的合成

取Wang-Leu-NHFmoc樹脂500 mg(載樣量為0.30 mmol·g-1)加入到固相合成反應(yīng)管中，用DCM浸泡20 min使樹脂充分溶脹，抽干待用。加入20%哌啶-DMF溶液(0.1 mol·L-1Oxyme)至樹脂完全淹沒(méi)，室溫(25 ℃)下振蕩5 min × 2脫去樹脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗滌樹脂各3次。將Fmoc-Ile-OH(297 mg，1 mmol)、Oxyme(142 mg，1 mmol)、DIC(155.0 μL，1 mmol)混溶于7 mL NMP，加入到樹脂中，于60 ℃下振蕩20 min，依次用DCM、DMF洗滌樹脂各3次。隨后根據(jù)多肽序列依次將Fmoc-氨基酸/正辛酸(1 mmol)、Oxyme(142 mg)、DIC(155 μL)混溶于7 mL NMP，加入到樹脂中，于60 ℃下振蕩20 min，重復(fù)脫保護(hù)→縮合→脫保護(hù)，直至所有氨基酸連接完成。縮合反應(yīng)中通過(guò)茚三酮-苯酚顯色監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。

1.2.2 肽鏈的游離

肽鏈連接完成后，將樹脂洗凈抽干，加入三異丙基硅烷(TIPS)∶H2O∶TFA=1∶1∶38(體積比)15 mL，室溫下振蕩4 h，過(guò)濾，用少許TFA洗滌樹脂，收集濾液。氬氣鼓泡吹走多余TFA，倒入冰乙醚沉淀離心后，棄上清，繼續(xù)用冰乙醚反復(fù)洗滌離心3次，氬氣吹干待用，得還原前粗品104.6 mg。

1.2.3 C端 Leu羧基的還原

將還原前粗品溶于THF中，于-15 ℃下加入NMM(1 eq.)、氯甲酸異丁酯(1 eq.)，攪拌1 min；加入NaBH4/H2O(3 eq.)于-15 ℃下攪拌4 h后，水淬滅；用乙酸乙酯萃取有機(jī)層，無(wú)水Na2SO4干燥后濃縮，得lipovelutibols A粗品81.5 mg。

1.2.4 lipovelutibols A的分離純化

將lipovelutibols A粗品用乙腈和水溶解，通過(guò)制備型RP-HPLC純化。色譜條件： YMC-Pack ODS-AQ色譜柱(250 mm×20 mm,5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；流動(dòng)相A為0.1%TFA水溶液，流動(dòng)相B為0.1%TFA乙腈溶液，梯度洗脫(0～60 min，流動(dòng)相B：40%～90%)；流速15.0 mL·min-1。收集主峰，冷凍干燥后得白色粉末46.2 mg，總收率40.0%。

1.2.5 分析與表征

對(duì)還原前粗品進(jìn)行HPLC分析，色譜條件：Waters Bridge C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm；4.6 mm×250 mm,5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；流動(dòng)相A為0.1%TFA水溶液，流動(dòng)相B為0.1%TFA乙腈溶液，梯度洗脫(0～30 min，流動(dòng)相B：5%～95%)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃。收集主峰，進(jìn)行HR-Q-TOF-MS測(cè)試。

對(duì)lipovelutibols A純品進(jìn)行HPLC分析，色譜條件同上；并對(duì)lipovelutibols A純品進(jìn)行HR-Q-TOF-MS測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC分析(圖3)

由圖3可知，還原前粗品的保留時(shí)間為24.125min；lipovelutibols A純品的保留時(shí)間為24.610 min，純度大于98%。

圖3 還原前粗品(a)及l(fā)ipovelutibols A純品(b)的HPLC圖譜Fig.3 HPLC spectra of unreduced peptide(a) and pure lipovelutibols A(b)

2.2 質(zhì)譜分析(圖4)

還原前粗品的分子式為C38H69N7O10,分子量為784.01 Da；lipovelutibols A純品的分子式為C38H71N7O9，分子量為770.03 Da。由圖4可知，還原前粗品分子離子峰為[M+H]+=784.5168，[M+Na]+=806.4985(圖4a)；lipovelutibols A純品分子離子峰為[M+H]+=770.5394，[M+Na]+=792.5198(圖4b)，還原前粗品、lipovelutibols A純品的分子量均與理論值相符。

圖4 還原前粗品(a)及l(fā)ipovelutibols A純品(b)的HR-Q-TOF-MS圖譜Fig.4 HR-Q-TOF-MS spectra of unreduced peptide(a) and pure lipovelutibols A(b)

3 結(jié)論

采用Fmoc多肽固相合成法，以Wang-Leu-NHFmoc樹脂為載體、Fmoc-Ile-OH為起始原料、DIC/Oxyme為縮合體系，按照l(shuí)ipovelutibols A的氨基酸序列由C端向N端依次偶聯(lián),肽鏈從樹脂上切割下來(lái)后，經(jīng)NaBH4、氯甲酸異丁酯在堿性條件下還原，再經(jīng)制備型RP-HPLC純化得lipovelutibols A，總收率40.0%。相比于液相合成法，固相合成法大大降低了每步產(chǎn)品純化的難度，操作更簡(jiǎn)單適用，總收率高，適用于同類型非核糖體多肽的化學(xué)合成。