響應面法優化QuEChERS提取凈化小麥中嘔吐毒素工藝

◎ 王媛媛

（安徽中青檢驗檢測有限公司，安徽 合肥 230088）

嘔吐毒素（Vomitoxin），主要成分為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），屬于單端孢霉烯族毒素，是小麥中常見的一種真菌毒素，是人類食品和動物飼料中檢出率、超標率最高的真菌毒素。嘔吐毒素對人體可引起惡心嘔吐、免疫力降低等癥狀，具有潛在的致癌、致畸、致突變作用。我國傳統飲食習慣中，糧谷比例遠大于西方國家，使得小麥中真菌毒素的危害性更加突出。

QuEChERS前處理技術涉及多項可變實驗條件，且條件間存在很大程度的相互作用，使用傳統單因素優化方法無法進行有效優化。本研究以小麥中嘔吐毒素回收率為指標，基于響應面法對QuEChERS前處理技術的相關參數建立擬合模型并進行了優化。通過方法驗證，該方法可有效應用于小麥中嘔吐毒素的提取凈化，供上機檢測，大幅度降低了前處理過程的經濟和時間成本[1-4]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU LCMS-8045島津液相色譜-串聯質譜聯用儀；JK-500型超聲波清洗器，TGL-16M離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；G560E渦旋混勻器，上海佳能；十萬分之一、萬分之一電子天平，德國賽多利斯公司；恒溫氮吹裝置。

小麥粉（市售）；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液購自壇墨；甲醇、乙腈、乙酸為色譜純試劑，水為一級水，其他試劑均為分析純；提取液：乙酸-乙腈溶液（1∶99）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

初始前處理方法基于QuEChERS技術[5]，前期已對其進行修改。精密稱取5 g小麥粉置于50 mL離心管，按100 μg·kg-1嘔吐毒素含量加標。加入提取液16 mL，超聲振蕩2 min至充分混勻。加入硫酸鎂6 g、醋酸鈉1.5 g，超聲振蕩1 min后10 000 r·min-1離心5 min。取上層清液6 mL轉移至15 mL凈化管（含有50 mg PSA、150 mg C18和900 mg MgSO4）中，渦旋2 min，以5 000 r·min-1的速度離心5 min，將全部上清液轉移到另一試管，50 ℃氮氣吹干，用乙腈-0.1%甲酸溶液（5∶95）定容至1 mL，經0.22 μm膜過濾后，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定，外標法定量。

1.2.2 色譜和質譜條件

（1）色譜條件。Shim-pack GISS-HP C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）色譜柱；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相：0.1%甲酸水（A），乙腈（B）。梯度洗脫：0～1.0 min，5% B；1.0～3.0 min，50% B；3.0～7.0 min，100% B；7.1～10 min，5% B。

（2）質譜條件。電噴霧（ESI+）離子源；霧化氣（N2）流量：3.0 L·min-1；干燥氣（N2）流量：10.0 L·min-1；加熱氣（Air）流量：10.0 L·min-1；DL管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；掃描方式：多反應監測（MRM）模式。母離子為m/z297.0，檢測離子對為m/z249.0、m/z231.0，其中m/z249.0為定量離子，錐孔電壓20 V，碰撞能量10 eV、10 eV。

1.2.3 數據處理

使用Design-Expert 12軟件進行試驗設計與數據統計分析。

1.2.4 標準工作曲線繪制

現配1 μg·mL-1混合標準液，然后逐級稀釋成需要的質量濃度，采用高效液相色譜-質譜測定，以質量濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準工作曲線。

1.2.5 響應面法設計及優化

以小麥中最主要真菌毒素污染物DON為主要分析對象，采用在空白基質中添加目標組分（加標量100 μg·kg-1）的方法，以DON回收率為指標，以前處理凈化階段的乙酸體積分數、硫酸鎂質量和醋酸鈉質量為3個自變量，進行Box-Behnken響應面擬合優化。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線的繪制

建立DON線性回歸方程為Y=454.22X+213.95，r=0.999 4，線性范圍為50～2 000 μg·L-1，檢出限為10 μg·kg-1，定量限為20 μg·kg-1。使用相對響應值法計算基質效應，方法平均基質效應為92%，在可接受范圍內。

2.2 響應面法優化和分析

Box-Behnken響應面模型方差分析見表1。使用二次多項式回歸，擬合得到DON回收率Y對3個因素A乙酸體積分數（%）、B硫酸鎂（g）、C醋酸鈉（g）的二次多項式方程為

該模型F=46.58，P＜0.000 1，表明該模型方程極顯著，失擬項F=0.110 9，P=0.949 2＞0.05，表明失擬項不顯著。二次項中A2、B2、C2、AB影響極顯著（P＜0.01），BC影響顯著（P＜0.05），表明各因素對回收率的影響不是簡單的線性關系。修正后R2=0.962 5，說明該模型能反映96.25%響應值的變化。

為考察各因素對萃取液吸光度的影響，將一個因素設為中心值，描繪對應兩因素的三維響應面圖，可知DON回收率在本實驗設定范圍內存在最大值。通過軟件分析得到Y取最大值時A=-0.792，B=0.310，C=-0.173，此時乙酸體積分數（A）為1.04%，硫酸鎂質量（B）為6.55 g，醋酸鈉質量（C）為1.654 g，回收率（Y）預測值為92.974%。考慮到實際可操作性，將其修正為乙酸體積分數（A）為1%，硫酸鎂質量（B）為6.6 g，醋酸鈉質量（C）為1.7 g，此時回收率（Y）預測值為92.966%。以該方法進行前處理，按照1.2方法測定目標物DON回收率，并與優化前方法驗證結果比較，優化后DON平均回收率從84.5%增加到了94.7%，相對標準偏差（RSD）為7.20%。選定最終QuEChERS前處理條件為乙酸體積分數1%，硫酸鎂質量6.6 g，醋酸鈉質量1.7 g。

2.3 方法應用和驗證

使用建立的QuEChERS前處理-液相色譜-串聯質譜法方法，對照GB 5009.111—2016同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法，對市售10種樣品進行對比測試，結果見表2。數據分析（不計未檢出）表明P=0.373，差異不顯著，說明本方法與國標方法沒有顯著差異。

表1 Box-Behnken響應面模型方差分析表

表2 建立方法與國標方法對比表

3 結論

本研究通過響應面優化，最終建立了基于QuEChERS前處理技術的小麥中嘔吐毒素前處理凈化方法。該方法相比于傳統方法處理簡單、速度快、成本低廉。與國標方法進行對比，不存在顯著性差異，可以滿足小麥中嘔吐毒素的定性和定量檢測要求。