高效液相色譜法測定蜜餞中檸檬黃的不確定度評定

◎ 張慧瓊，鄭陸紅，陳嘉敏

（1.廣東省食品工業公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省質量監督食品檢驗站，廣東 廣州 511442）

蜜餞，是一種以果蔬等為主要原料，添加（或不添加）食品添加劑和其他輔料，經糖或蜂蜜或食鹽腌制（或不腌制）等工藝制成的制品[1]。從國家市場監督管理總局公布的2019—2021年食品監督抽檢數據來看，著色劑的不合格批次數和涉及的著色劑種類呈上升趨勢[2]。

食用檸檬黃是一種水溶性合成色素，外觀呈鮮艷的嫩黃色。適量的檸檬黃可以安全地用于食品、飲料、藥品及化妝品的著色，還可用于蠶絲、羊毛的染色等。由于合成色素的確能改善食品的色澤，為刺激消費者的購買欲，制作商將其廣泛用于冷凍飲品、糖果包衣、果凍以及蜜餞等的著色。但是合成著色劑存在一定的毒性、致泄性，還會影響兒童的智力發育[3]。其中，檸檬黃可能會對人體引發過敏癥狀，包括焦慮、哮喘、蕁麻疹、視覺模糊偏頭痛等。因此，在蜜餞中檢測檸檬黃含量非常有必要。食品檢驗的工作程序復雜，實驗過程中難免會受到各種因素的影響，導致檢測結果和真實值之間出現一定的誤差。為了使分析結果更加客觀公正，需要引入測量不確定度。不確定度表明測量結果可能的分散程度，指對測量正確性的可疑程度，是測量結果質量高低的一種定量表達方式[4]。本文根據《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）[5]，以蜜餞中檸檬黃的檢測為例，依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[6]，探討食品檢測過程中測量不確定度來源、影響因素和測定方法，以期為食品檢驗中測量不確定度的研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌蜜餞：市售。

檸檬黃標準品：海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司；檸檬酸：國藥集團化學試劑有限公司；聚酰胺（100～200目）：源葉有限公司；甲酸：廣州化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）：上海星可高純溶劑有限公司；乙酸銨：福晨（天津）有限公司；氨水：廣州化學試劑有限公司；無水乙醇：成都市科隆化學品有限公司；實驗室用水為Milli-Q Advantage A10制備的一級水，Millipore公司；乙酸：康科德有限公司；0.45 μm水相濾膜：艾杰爾。

1.2 儀器與設備

1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（DAD）：安捷倫科技有限公司；C18色譜柱（250 mm×4. 6mm，5 μm）：飛諾美有限公司；電子天平（十萬分之一）：梅特勒-托利多有限公司；超聲波清洗機（SB25-12DT）：新芝生物科技股份有限公司；漩渦混合器（IKA MS 3 basic）：德國IKA公司；純水機（Milli-Q Advantage A10）：默克密理博公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS-26）：上海一恒科學儀器有限公司；玻璃砂芯漏斗（G3）：帆船牌；隔膜真空泵：津滕有限公司。

1.3 實驗與方法

1.3.1 標準系列溶液的配制

從檸檬黃的標準儲備液（1 000 μg·mL-1）中分別吸取0.002 mL、0.010 mL、0.100 mL、0.500 mL和1.000 mL至10 mL容量瓶中，用一級水定容，配制成0.2 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1的標準系列溶液。

1.3.2 試樣前處理

根據《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）[5]，將蜜餞均勻粉碎后，準確稱取試樣5.00 g，放入100 mL小燒杯中，加水30 mL，溫熱溶解。樣品溶液加檸檬酸溶液（20%）調pH到6，加熱至60 ℃，將1 g聚酰胺粉加少許水調成糊狀，倒入樣品溶液里并攪拌。以G3垂融漏斗抽濾，用60 ℃pH為4的水洗滌5次，接著用甲醇-甲酸混合液（6+4，體積比）洗滌5次，再用水洗至中性；用乙醇-氨水-水混合液（7+2+1，體積比）解吸5次，直至色素完全解吸。收集洗脫液，加乙酸中和，蒸發至近干，加水溶解，定容至5 mL容量瓶，混勻后經0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液供高效液相色譜儀分析測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：35 ℃，流動相：以甲醇為A相，以0.02 mol·L-1乙酸銨溶液為B相，梯度洗脫，洗脫方式見表1，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，波長428 nm，二極管陣列檢測器檢測。

表1 梯度洗脫表

2 結果及分析

2.1 數學模型

式中：X為試樣中檸檬黃的含量，g·kg-1；C為進樣液中檸檬黃的濃度，μg·mL-1；V為試樣定容體積，mL；m為試樣質量，g；1 000為換算系數。

2.2 分析不確定度的來源

根據測定方法的主要步驟，高效液相色譜儀檢測蜜餞中檸檬黃含量的不確定度主要有以下5類[7]。①標準工作液配制產生的相對標準不確定度。②樣品稱量產生的相對標準不確定度。③試樣定容體積產生的相對標準不確定度。④求樣品濃度時用最小二乘法擬合標準曲線產生的相對標準不確定度。⑤樣品重復性測定引入的相對標準不確定度。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜法測定蜜餞中檸檬黃的不確定度來源圖

2.3 標準不確定度分量評定

2.3.1 標準工作液配制產生的相對標準不確定度urel(B)

檸檬黃標準物質是由北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司提供，該標物由證書給出的純度為1 000 μg·mL-1，相對擴展不確定度為1.0%，正態分布（包含因子k=2），相對標準不確定度為

2.3.2 樣品稱量產生的相對標準不確定度ucrel(m)

依據方法要求，使用千分之一的天平稱量，稱取混合均勻的試樣5.000 g，根據檢定證書，該天平給出的0～50 g（0～5 000 e，e=10 d，d=1 mg)稱量范圍的允許誤差為5 mg，按均勻分布則引入的標準不確定度為相對標準不確定度為

2.3.3 樣品定容體積產生的相對標準不確定度ucrel(V)

（1）標定容量瓶帶來的不確定度。樣品經前處理，最后用5 mL容量瓶定容，根據《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[8]，A級單標線5 mL容量瓶，其容量允許差為±0.020 mL，按均勻分布引入的標準不確定度為，相對標準不確定度為

（2）由溫度效應引入的不確定度。玻璃器皿在20 ℃校準，實驗室的溫度在（20±5）℃變動。可通過計算該溫度范圍和體積膨脹系數來評定該影響引起的不確定度。水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1，由溫度波動引起的體積偏差為V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，按均勻分布，由溫度變化帶入的相對標準不確定度為

（3）樣品定容體積產生的相對標準不確定度ucrel(V)。試樣定容體積產生的合成相對標準不確定度為

2.3.4 求樣品濃度時用最小二乘法擬合標準曲線產生的相對標準不確定度urel(c)

使用校準曲線計算檸檬黃的濃度，配制5個標準溶液，濃度分別為0.200 0 μg·mL-1、1.000 0 μg·mL-1、10.000 0 μg·mL-1、50.000 0 μg·mL-1和100.000 0 μg·mL-1，平均值每個點各測3次，結果見表2。

表2 檸檬黃標準系列溶液測定結果表

線性最小二乘法擬合曲線的相關系數r2為1.000，以含量為橫坐標，峰面積為縱坐標得方程y=bx+a=31.608x+0.378，殘余標準偏差為

測 量 提 取 溶 液 兩 次 得 濃 度 為36.10 μg·mL-1、36.52 μg·mL-1，即平均值c=36.31 μg·mL-1，求樣品濃度時用最小二乘法擬合標準曲線產生的標準不確定度為

式中b為斜率，p為測試的次數，n為測試校準溶液的次數，求樣品濃度時用最小二乘法擬合標準曲線產生的相對標準不確定度為

2.3.5 樣品重復性測定引入的相對標準不確定度urel(X)

影響測量結果重復性的因素主要有人員操作和讀數差異、樣品不均勻、測量儀器的變動性等。各種隨機因素合并引起的重復性相對標準不確定度，可在重復性測量條件下統計分析一系列測量結果得到。用同一臺高效液相色譜儀，在重復性條件下對蜜餞進行了6次獨立重復試驗，測定結果分別為0.034 g·kg-1、0.036 g·kg-1、0.036 g·kg-1、0.035 g·kg-1、0.033 g·kg-1、0.035 g·kg-1。

以標準偏差表示測量的重復性，按貝塞爾公式計算，則

本實驗測量6個樣品，平均值為0.035 g·kg-1，當報告平均值時，應用早先預評估的標準偏差，測量的平均值的標準不確定度為

2.3.6 合成相對不確定度、相對擴展不確定度和擴展不確定度的評定

（1）合成相對標準不確定度的評定。綜合以上由標物、樣品稱量、樣品前處理過程、求樣品濃度時最小二乘法擬合標準曲線和重復性試驗5個方面產生的相對標準不確定度，得到的合成相對標準不確定度為

（2）相對擴展不確定度和擴展不確定度的評定。當置信概率為95%時，取包含因子k=2，相對擴展不確定度為Urel=k×ucrel(W)=2×0.015 4=3.08%。樣品中檸檬黃檢出0.035 g·kg-1，則其擴展不確定度為

2.3.7 測量結果不確定度報告

根據不確定度評估后，檸檬黃測定結果為0.035 g·kg-1；擴展不確定度為U=0.001 g·kg-1（k=2），其結果可表示為X檸=(0.035±0.001) g·kg-1，k=2。

3 結論

本文以檸檬黃為例，分析了高效液相色譜法測定蜜餞中檸檬黃的不確定度評定，本實驗中，前處理過程產生的相對標準不確定度最大，即本實驗中前處理是影響結果的關鍵，因此在檢驗工作的過程中，需要給予重視，確保檢驗結果的準確可靠。