高效液相色譜法測定熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的不確定度評定

◎ 石劍夫，焦文佳，陳 茹

（1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，廣東 廣州 511442）

苯并[a]芘是苯與芘稠合而成的一類多環(huán)芳烴，具有明顯致癌作用[1-2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，食品中的苯并[a]芘的來源有兩種：由工業(yè)生產(chǎn)、煤炭的不完全燃燒產(chǎn)生，通過空氣、水流和土壤進入糧食、蔬菜瓜果、水產(chǎn)和動物制品中；高溫烘烤、油炸、煙熏、烹調(diào)時，食品中的碳水化合物、蛋白質(zhì)等有機物發(fā)生裂解反應(yīng)，再經(jīng)過一系列化學反應(yīng)形成苯并[a]芘。GB 2762—2017[3]規(guī)定，熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的安全限量為5.0 μg·kg-1。因此，準確測定熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的含量非常重要。

不確定度評定是一種評價檢測方法科學性、合理性的常用方式，可以為測試結(jié)果的準確性提供參考。此次熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的檢測按照國家標準GB 5009.27—2016[4]開展，并建立不確定度來源分析數(shù)學模型，以評定檢驗過程中產(chǎn)生的不確定度[6-8]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

H-class plus超高效液相色譜儀（Waters）；ME204E/02電子天平，萬分之一，梅特勒-托利多（上海）有限公司。苯并[a]芘（100.0%），CAS:50-32-8（AccuStandard）；甲醇（LC-MS，Merck）；乙腈（LC-MS，Merck）；試驗用水均為一級水。

1.2 提取樣液

嚴格按照標準GB 5009.27—2016[4]進行試樣制備、提取和凈化。將柴魚花片試樣經(jīng)過制樣、稱樣、正己烷提取、苯并[a]芘分子印跡柱過柱、復(fù)溶和過膜等標準化步驟獲得樣液[4]。

1.3 標準曲線的繪制

用移液器將苯并[a]芘標物轉(zhuǎn)移至儲備液瓶中，得苯并[a]芘儲備液（100.4 μg·mL-1）。用移液器吸取苯并[a]芘儲備液20 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得苯并[a]芘中間液200.8 ng·mL-1，當天配制。分別移取中間液0.025 mL、0.050 mL、0.250 mL、0.500 mL、1.000 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得標準曲線系列溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈+水=（88+12）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm。

2 數(shù)學模型

食品中苯并[a]芘的含量測定采用標準曲線法定量，定量結(jié)果按下面的公式計算。

式中：X為試樣中苯并[a]芘的含量，μg·kg-1；V為樣液最終定容體積，mL；Cx為標準曲線上對應(yīng)的苯并[a]芘的質(zhì)量濃度，ng·mL-1；m為試樣質(zhì)量，g；F為濃縮倍數(shù)；1 000為ng·g-1換算成μg·kg-1的換算因子。

3 不確定度來源分析

通過分析苯并[a]芘含量的計算公式，食品中苯并[a]芘檢驗的不確定度來源主要有樣品質(zhì)量、前處理過程、標準溶液、標準曲線擬合及測量重復(fù)性等。詳情見圖1。

圖1 不確定度來源分析圖

4 不確定度分析

4.1 由苯并[a]芘標準曲線引入的不確定度分量urel,1

4.1.1 由苯并[a]芘標準物質(zhì)引入的不確定度分量urel,2

通過查詢所使用的苯并[a]芘標準品的標準物質(zhì)證書，其擴展不確定度為2.4%，取置信水平p=95%，包含因子k=2，則可得其相對標準不確定度為

4.1.2 使用器具進行標準曲線配制而引入的不確定度urel,3

使用容量瓶定容和使用移液器移取溶液是標準曲線配置的主要不確定度來源。本實驗所使用的容量瓶均通過檢定，符合標準要求。依據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）和移液器的校準證書，按照三角分布計算，使用容量瓶定容和使用移液器移取溶液引入的不確定度見表1。本實驗在標準曲線配置過程中引入的不確定度為

表1 使用容量瓶和移液器引入的不確定度表

4.1.3 環(huán)境溫度變化引入的不確定度urel,4

本實驗在（20±4）℃條件下進行，經(jīng)查，乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，按照矩形分布計算，在配制標準曲線時由于環(huán)境溫度變化而引入的不確定度見表2。

表2 環(huán)境溫度變化引入的不確定度表

環(huán)境溫度變化引入的合成相對標準不確定度為

由苯并[a]芘標準曲線引入的合成相對標準不確定度分量為

4.2 標準曲線擬合及結(jié)果重復(fù)性引入的相對標準不確定度urel,5

4.2.1 結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度分量urel,6

在相同條件下，按照標準檢驗方法對同一試樣重復(fù)檢驗6次，檢驗結(jié)果分別為21.4 μg·kg-1、21.3 μg·kg-1、21.1 μg·kg-1、21.5 μg·kg-1、21.5 μg·kg-1和21.5 μg·kg-1，則重復(fù)性不確定度分量為

重復(fù)性相對標準不確定度分量為

4.2.2 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel,7

使用高效液相色譜儀將苯并[a]芘標準曲線系列溶液測定3次，分別得到苯并[a]芘標準曲線系列溶液各濃度各3個峰面積，分別取平均值，以苯并[a]芘標準曲線系列溶液的濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），求其回歸方程和相關(guān)參數(shù)，詳情見表3。

表3 苯并[a]芘標準曲線系列溶液3次測定的結(jié)果表

計算得到苯并[a]芘標準曲線的線性回歸方程為y=60 421x+2 900.7，相關(guān)系數(shù)r=1，由此可知，苯并[a]芘濃度和峰面積具有顯著的線性相關(guān)性。

回歸直線的標準偏差（y殘差的標準差）計算為

式中：m為每個測量點重復(fù)測量次數(shù)，m=3；n為測量點數(shù)，n=5；yij為儀器各點響應(yīng)值；yi為回歸直線計算值。

由苯并[a]芘的峰面積引入的不確定度分量u1為

回歸系數(shù)斜率的不確定度u2為

回歸系數(shù)截距的不確定度u3為

不確定度分量u1～u3符合應(yīng)用公式（3）。

先計算器傳播系數(shù)，對線性方程y=ax+b求偏導(dǎo)知：

其相對標準不確定度分量為

由結(jié)果重復(fù)性和標準曲線擬合引入的合成相對標準不確定度分量為

4.3 試樣前處理過程中引入的相對標準不確定度urel,8(Q)

4.3.1 稱量試樣引入的相對標準不確定度urel,9(m)

使用萬分之一天平稱取6份試樣，其質(zhì)量分別為1.002 4 g、1.002 6 g、1.001 7 g、1.003 9 g、1.006 7 g和1.005 8 g，計算得方差為0.000 003 37。經(jīng)查，試樣稱量所使用的萬分之一天平，其最大允差為0.50 mg，按矩形分布稱量試樣引入的標準不確定度為

稱量試樣引入的相對標準不確定度為

4.3.2 試樣前處理過程中所用器量引入不確定度urel,10(V3)

取5 mL正己烷（定容體積）時用5 mL移液器，其最大允許誤差為±30.00 μL，依據(jù)三角分布

最終定容體積時用1 000 μL移液器，其最大允許誤差為±10.00 μL，依據(jù)三角分布移取1 mL乙腈時引入的相對不確定度為

取0.5 mL復(fù)溶液于1 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線時。使用的1 000 μL移液器最大允許誤差為±5.00 μL，依據(jù)三角分布移取1 mL乙腈時引入的相對不確定度為

使用的1 mL容量瓶最大允許誤差為±0.010 mL，依據(jù)三角分布其相對不確定度為

相對標準不確定度為

4.3.3 溫度不同引入的標準不確定度分量urel,15(T3)

實驗在（20±4）℃條件下進行，經(jīng)查，正己烷的膨脹系數(shù)為1.36×10-3℃-1，乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，檢定標準溫度（20 ℃）和溶液溫度不同引入的不確定度分量urel,15(T3)，按照矩形分布計算。

4.3.4 樣品處理過程中引入的相對標準不確定度urel,8(Q)用5 mL移取兩次引入的不確定度為

4.4 合成相對標準不確定度的評定

經(jīng)過本實驗可得食品中苯并[a]芘測定的各主要不確定度分量（表4），計算可得總合成相對擴展不確定為

表4 食品中苯并[a]芘測定的合成相對擴展不確定的分量表

4.5 評定本次檢驗的相對擴展不確定度

本次檢驗的相對擴展不確定度公式為Urel=k×urel，假設(shè)本次檢驗過程誤差符合正態(tài)分布，取置信水平p=95%，包含因子k=2，則本次檢驗的相對擴展不確定度為Urel=2×0.037×100%=7.4%。

苯并[a]芘相對擴展不確定度為7.4%，樣品檢出21.3 μg·kg-1，則其擴展不確定度為U=21.3×7.4%=1.6 μg·kg-1。

5 結(jié)論

本次采用高效液相色譜法檢驗熏、烤水產(chǎn)品中的苯并[a]芘含量，經(jīng)過分析過程和計算不確定度，可知配制苯并[a]芘標準溶液引入的不確定度最大，建議從事該方法檢驗的檢驗人員在標準溶液配制過程中應(yīng)盡可能地選擇高精度的器具，定期對相關(guān)器具和儀器進行檢定或校準，保證器具和儀器處于正常工作狀態(tài)。同時，檢驗人員也應(yīng)按照標準要求規(guī)范操作，通過培訓(xùn)學習提高檢驗人員專業(yè)技能，減少人工誤差，從而保證檢驗結(jié)果準確可靠。