超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法快速測定野生蘑菇中6種鵝膏肽類毒素

◎ 林子豪，彭名軍，周慶瓊，曾豪威，戚 平

（廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400）

近年來，野生蘑菇中毒事件屢見不鮮，中毒類型包括急性肝損害型、神經精神型、光過敏皮炎型、胃腸炎型等[1]。其中急性肝損害型占因蘑菇中毒死亡事件總數的70.49%，主要由鵝膏肽類毒素引起。鵝膏肽類毒素包括鵝膏毒肽和鬼筆毒肽，其化學性質穩定，一般的烹調加工不會破壞其毒性[2]。常見的鵝膏毒肽有α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽，其半數致死量分別為0.3 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1、0.2 mg·kg-1。鵝膏毒肽進入人體后被肝細胞快速吸收，中毒患者先后經歷潛伏期、胃腸炎期、假愈期和內臟損害期4個階段，若不及早治療會導致死亡[3]。鬼筆毒肽常伴隨鵝膏毒肽出現，但不被人體吸收。常見的鬼筆毒肽包括羧基三羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽。鵝膏毒肽和鬼筆毒肽均為環肽類毒素，其中鵝膏毒肽是雙環八肽，鬼筆毒肽為雙環七肽，同種類毒肽的差異在于取代基的區別[4]。

目前，測定鵝膏肽類毒素主要有化學顯色法[5]、酶聯免疫法[6]、分光光度法[7]、高效液相色譜法[8]和液相色譜串聯質譜法[9-11]。雖然液相色譜串聯質譜法是目前熱門的分析方法，但大多數研究采用分辨率較低的四極桿串聯質譜進行分析，其質量精度僅能達到整數級別，在測定時容易受到復雜基質的干擾。四極桿飛行時間質譜相比四極桿串聯質譜具有更高的分辨率，區別于串聯四極桿的多反應監測模式，四極桿飛行時間質譜采用全質譜信息掃描模式，能夠同時獲得高精確度的母離子及碎片離子信息，根據需要選擇母離子或碎片離子精確質荷比進行定量，同時能結合二級質譜精確質量數推斷碎片結構和質譜斷裂機理。本研究擬通過優化色譜質譜條件，結合高稀釋比技術[12]，建立野生蘑菇中6種鵝膏肽類毒素的超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole-Time-of-Flight Mass Spectrometry，UPLC-Q-TOF MS）快速分析方法，為鵝膏肽類毒素的快速鑒定和相關中毒事件應急處置提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Waters Xevo G2-XS超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜儀，配電噴霧離子源（美國Waters公司）；Allegra X-30R離心機（美國Beckman Coulter公司）；M37610-33CN渦旋混勻器（德國IKA公司）；MS204TS/02電子天平（0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）。

α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽（純度≥90%，美國Cayman Chemical公司）；羧基三羥鬼筆毒肽：10 μg·mL-1，福州勤鵬生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；乙酸、甲酸（LC/MS級，美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽標準溶液（0.1 mg·mL-1）：準確稱取1 mg標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL，-20 ℃保存。

1.2.2 樣品前處理

將樣品粉碎后，準確稱取試樣0.20 g（精確至0.01 g）置于15 mL聚丙烯刻度離心管中，加入5 mL甲醇-水（V/V=50/50），渦旋振蕩5 min，在10 000 r·min-1下離心5 min，上清液轉移至另一離心管中，重復提取一次，合并提取液。移取0.25 mL上清液，加入0.75 mL水，渦旋混勻并過0.22 μm濾膜后，上機測定。

1.2.3 液相色譜-串聯質譜條件

（1）液相條件。柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.3 mL·min-1；色 譜 柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為水，流動相B為0.1%乙酸-乙腈。洗脫梯度：0～1.5 min，3% B；1.5～3.0 min，3%→35% B；3～5 min，35%→50% B；5～6 min，50%→80% B；6.0～6.1 min，80%→3% B；6.1～8.0 min，3% B。

（2）質譜條件。采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+），毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，錐孔氣流速50 L·h-1，脫溶劑氣流速800 L·h-1，采集模式為MSe模式，分辨率大于20 000；質量范圍為50～1 200 Da；Lock Spray雙噴霧離子源：亮氨酸腦啡肽溶液，ESI+為556.277 1 Da。6種鵝膏肽類毒素的質譜信息見表1。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

本研究比較了乙腈和水、0.1%甲酸-乙腈和水、0.1%乙酸-乙腈和水等3種流動相的分離效果和信號響應。以乙腈和水為流動相時，母離子主要表現為[M+Na]+峰，[M+H]+峰響應較差。以0.1%甲酸-乙腈和水為流動相時，α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽不能實現基線分離，α-鵝膏毒肽的13C同位素峰（相對豐度為43%）將會對β-鵝膏毒肽的測定造成干擾。改用酸性較弱的0.1%乙酸-乙腈和水進行色譜分離，[M+H]+峰響應相比以乙腈和水為流動相有了較大提升，α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽也基本實現基線分離，6種鵝膏肽類毒素的色譜圖如圖1所示。因此本研究采用0.1%乙酸-乙腈和水作為流動相。

表1 6種鵝膏肽類毒素的質譜信息表

圖1 6種鵝膏肽類毒素的色譜圖

2.2 二級質譜特征碎片

6種鵝膏肽類毒素的特征碎片見表1。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽均屬于鵝膏毒肽，具有相同的母核，α-鵝膏毒肽與β-鵝膏毒肽僅在R1位有一個-NH2和-OH的差異，γ-鵝膏毒肽僅比α-鵝膏毒肽在R2位少一個-OH。通過精確質量數擬合分析，推測α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽的二級特征碎片m/z259為羥脯氨酸和二羥基異亮氨酸組成的二肽，γ-鵝膏毒肽的二級特征碎片m/z243則是羥脯氨酸和一羥基異亮氨酸組成的二肽，另一組特征碎片m/z86來自羥脯氨酸脫羧后的碎片離子。羧基二羥鬼筆毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基三羥鬼筆毒肽均屬于鬼筆毒肽，也具有相同的母核，通過精確質量數擬合分析，推測羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽的二級特征碎片m/z330為色氨酸和二羥基亮氨酸組成的二肽，羧基三羥鬼筆毒肽的二級特征碎片m/z346則是色氨酸和三羥基亮氨酸組成的二肽，另一組特征碎片m/z157來自色氨酸脫羧后的碎片離子。

2.3 基質效應的考察

樣品的基質效應ME=100%×（樣品基質中目標物峰面積）/（純溶劑中目標物峰面積），與樣品的稀釋倍數相關。當基質效應控制在80%～120%時，可以認為基質效應較弱，基本不影響樣品定量。由于在中毒事件應急處置過程中不宜采用較為復雜的前處理方式，因此本研究在滿足方法靈敏度的前提下，通過增大樣品稀釋倍數以消除基質效應的干擾。考察了野生蘑菇樣品在不同稀釋倍數下的基質效應，發現當稀釋倍數為200時基本無基質效應，結果如圖2所示。

2.4 方法學驗證

6種鵝膏肽類毒素的保留時間、線性方程、相關系數和回收率見表2。結果表明，6種鵝膏肽類毒素在5～100 ng·mL-1呈現良好的線性關系，線性相關系數均大于0.995，檢出限為0.4 mg·kg-1，定量限為1 mg·kg-1。以空白野生蘑菇為樣品，在0.1～8.0 mg·kg-1的水平下進行加標回收實驗，平均回收率為74.1%～119.9%，相對標準偏差為0.1%～6.7%（n=6）。

2.5 實際樣品的測定

按照本研究建立的方法，對廣州周邊采集到的10個野生蘑菇樣品進行檢測，在其中2個樣品中檢出部分鵝膏肽類毒素，具體結果見表3。

圖2 6種鵝膏肽類毒素基質效應圖

表2 6種鵝膏肽類毒素的保留時間、線性方程、相關系數和回收率表

表3 陽性野生蘑菇樣品的檢測結果表（單位：mg·kg-1）

3 結論

本研究通過優化儀器條件和樣品的稀釋倍數，建立了基于溶劑標準校正的6種鵝膏肽類毒素的UPLCQ-TOF MS快速分析方法。對采集到的10個野生蘑菇樣品進行檢測，在其中2個樣品中檢出了鵝膏肽類毒素。本方法快速準確，適合于野生蘑菇中6種鵝膏肽類毒素的快速檢測。