QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測糧食中4種新型真菌毒素的研究

◎ 狄 慧，賀麗霞，陳佳琛

（張家口市食品藥品檢驗中心，河北 張家口 075500）

真菌毒素是一種具有生物毒性的次級代謝產物，它是由某些絲狀真菌在適宜的環(huán)境下生長所產生的，包括曲霉、青霉、鐮刀霉、鏈格孢霉、棒孢霉和毛殼菌等。其中麥角生物堿和青霉酸是最先被分離純化的真菌毒素，其他真菌毒素于20世紀30年代后相繼被分離純化，然而，對真菌毒素的真正研究是從1962年黃曲霉毒素被發(fā)現(xiàn)開始的。目前已知的真菌毒素有400多種，其中有十幾種真菌毒素嚴重危害人和動物的健康，主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素類、玉米赤霉烯酮類和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等[1-3]及一些新型真菌毒素，包括白僵菌素和恩鐮孢菌素[4]等。糧食、水果、干果等食品均有可能被真菌毒素污染，其中糧食及其制品污染最為嚴重[5-6]，因此，建立糧食中多種真菌毒素的快速檢測方法尤為重要。

傳統(tǒng)的真菌毒素檢測方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法[7]等，但均存在耗時長、檢測種類單一的弊端，本研究中的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法實現(xiàn)了多種真菌毒素的同時、高效、快速的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

配有電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）的串聯(lián)四極桿質譜儀，SCIEX Triple QuadTM5500型質譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；LC-30AD型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；CAPCELL PAK C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）（日本資生堂公司）；3-18KS型高速離心機（德國SIGMA公司）；BTV-100渦旋混合器（上海一恒科技有限公司）；HGC-12A型氮吹濃縮儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；CP225D精密分析電子天平（德國賽多利斯公司）。

甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；N-丙基乙二胺（PSA，40～60 mm）、C18（40 mm）（天津博納艾爾杰科技公司）；4種真菌毒素標準品（純度均大于98.0%，Alexis）。

1.2 樣品來源

樣品為實驗室所有的陰性樣品。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18（2.1 mm×100 mm，2 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1，進樣體積：3 μL；洗脫梯度見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件表

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源ESI；監(jiān)測掃描方式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；掃描模式：正離子掃描；離子源溫度：600 ℃；噴霧電壓：5 500 V；氣簾氣：35 psi；噴撞氣：9 psi；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：60 psi；氣體：氮氣。4種真菌毒素UPLC-MS/MS測定參數見表2。

表2 4種真菌毒素UPLC-MS/MS測定參數表

1.3.3 樣品前處理方法

糧食樣品經粉碎后過篩（孔徑≤2 mm），裝入密封袋，備用。準確稱取混合均勻的樣品2 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加20 mL水，渦旋混勻30 s，浸泡30 min后，加入5.0 mL的1%乙酸乙腈，混勻后，加入4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉，立即旋渦混勻1 min，再加入10.0 mL 1%乙酸乙腈，立即旋渦混勻1 min，超聲處理10 min，離心10 min（9 000 r·min-1）。吸取上述乙酸乙腈提取液8 mL至含有1 200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18的離心管中，渦旋1 min，離心5 min（5 000 r·min-1），取上清液過0.22 μm微孔濾膜，待UPLC-MS/MS法測定。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取液的優(yōu)化

本實驗分別使用甲醇、乙腈、1%乙酸-乙腈和1%乙酸-甲醇作為提取液進行提取，結果顯示1%乙酸-乙腈作為提取液時，目標化合物的雜峰最少且總體回收率最好，因此選擇1%乙酸-乙腈作為提取液。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

本實驗分別使用不同比例的PSA和C18來進行凈化，結果顯示PSA為150 mg，C18為200 mg，MgSO4為1 200 mg時，基質效應影響最小且回收率最高，因此最終選擇150 mg PSA、200 mg C18、1 200 mg MgSO4進行凈化。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實驗分別使用了甲醇-水、乙腈-水、0.05%甲酸水-0.05%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-0.05%甲酸乙腈、甲醇-5 mmoL·mL-1乙酸銨、乙腈-5 mmoL·mL-1乙酸銨溶液作為流動相，結果顯示在使用甲醇-水、乙腈-水作為流動相時，個別峰峰型較差且雜峰較多，在0.05%甲酸水-0.05%甲酸甲醇為流動相洗脫時分離度最好且雜峰少、響應值較高，因此，選擇0.05%甲酸水-0.05%甲酸甲醇為流動相進行洗脫。4種真菌毒素的色譜圖見圖1。

圖1 4種恩鐮孢菌素正模式MRM色譜圖

2.3 方法的驗證

2.3.1 標準曲線和檢出限

根據4種真菌毒素的響應強弱，配制不同質量濃度的混合標準溶液標準曲線。以各個真菌毒素峰面積的值（Y）對其質量濃度（X）進行線性回歸方程，以空白樣品為基質，結果表明，4種真菌毒素在2～100 ng·mL-1范圍內線性關系系數在0.99 288～0.99 791。根據4種真菌毒素在質譜MRM模式下響應不同，將其配制成不同濃度的混合標準溶液，取藜麥空白樣品作為基質，添加4種真菌毒素的混合標準溶液，按照樣品前處理方法進行處理，測定分析后，按照3倍信噪比得到最低檢出限，按照10倍信噪比得到最低定量限，結果如表3所示。真菌毒素的檢出限為1.50～2.24 μg·kg-1，定量限為4.40～7.33 μg·kg-1。

表3 4種真菌毒素標準溶液通過LC-MS-MS分析所得的標準工作曲線、相關系數、檢出限、定量限表

2.3.2 回收率與精密度

取小米空白樣品（為實驗室已有陰性樣品），分別添加不同濃度的4種新型真菌毒素的混合標準溶液，按上述樣品處理步驟進行加標樣品前處理，測定高中低3個水平的回收率。結果見表4，4種新型真菌毒素的平均回收率為85.4%～99.5%，相對標準偏差為1.8%～6.8%。

表4 4種化合物的回收率和相對標準偏差表

3 結論

本實驗通過對糧食樣品的前處理的優(yōu)化（包括提取、凈化的優(yōu)化），色譜條件及質譜條件的優(yōu)化，建立了一種可以同時檢測糧食類食品中4種新型真菌毒素的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法。本方法具有回收率較高并且穩(wěn)定，快速、簡便、靈敏、成本低、實用等優(yōu)點，可作為糧食中多種真菌毒素的協(xié)同檢測方案進行推廣應用，對食品安全的保障奠定了一定的基礎。