柱前衍生-液相色譜法測定食品中?；撬岷康牟淮_定度評定

◎ 趙夢珂，謝嶠菲，田 燕，李永敏，李 瑩，王 蕊

（中檢科（北京）測試技術有限公司，北京 100123）

為保障舌尖上的安全和衛生，食品生產企業必須在化學檢測實驗室內對食物的質量指標與安全參數進行化學測試，檢測的結果將是企業制定產品品質管理制度、執法機關對食品安全實施有效監督管理的重要依據。但是受客觀因素的影響，化學測定的結果會出現偏差[1]。為獲得更準確的數據，引入了不確定度這一概念來對檢測結果進行進一步的評價。不確定度是一種測量結果質量的評定方式，這一概念包括了標準不確定度和擴展不確定度。標準不確定度是由標準偏差來表示測量結果的不確定度；擴展不確定度是以合成標準不確定度的倍數表示的測量不確定度，可以確定測量結果的可疑范圍，表明測量值會在某一概率下（即置信水平）落入該區間范圍內。目前國際上廣泛認可測量不確定度這一參數，并推薦使用不確定度來定量說明測量結果的質量[2]。

測量不確定度評定在化學檢測的很多方面都有應用[3-5]，如有些脂溶性維生素有最大限量，檢測結果在最大限量附近時，需要不確定度評定營養素是否超出使用限量；有些毒素、添加劑不得檢出，檢測結果在檢出限附近時，需要不確定度評定有害物質的風險；有些必須添加的維生素則有最小限量，檢測結果在最小限量附近時，需要不確定度評定營養素的添加是否不足。在實驗室很多方面的數據評定中，不確定度都能有所應用。以?；撬釣槔?，這種氨基酸在嬰幼兒的生長以及發育的過程中起到了重要作用，但是不可過量也不能缺乏。因此，我國嬰幼兒食品2010版標準規定?；撬岬暮俊?.0 mg/100 kJ[6-8]，2021版標準規定牛磺酸的含量在0.8～4.0 mg/100 kJ[9-11]。當實驗室檢測數值處于臨界值時，就體現了實驗室不確定度對于判斷產品是否合格的重要意義。本文根據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2021）中不確定度的評定方法[12]，對GB 5009.169—2016第二法丹磺酰氯柱前衍生法[13]的檢測結果的不確定度進行評定，希望能在實驗室質量控制中加以應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

奶粉質控樣品，貨號為QC-IP-707，購自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心；?；撬針藴势?，純度99.9%，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；乙腈（色譜純），購自上海安譜實驗科技股份有限公司；冰乙酸、鹽酸、無水碳酸鈉、乙酸鈉、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅（均為分析純），購自國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸甲胺（分析純）、丹磺酰氯（色譜純），均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：LC-20AT，島津企業管理（中國）有限公司；電子天平：ME204E，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；超聲波提取器：KQ218，昆山市超聲儀器有限公司；pH計：FE28，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；離心機：Centrifuge 5810R，艾本德中國有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛磺酸含量的測定

根據GB 5009.169—2016的第二法丹磺酰氯柱前衍生法對乳粉樣品進行測定。

1.2.2 數學模型的建立

試樣中牛磺酸的含量按下式進行計算[13]。

式中：X為?；撬岬臋z測結果，mg/100 g；c為上機液中牛磺酸的濃度，μg·mL-1；V為實驗過程中的定容體積，mL；m為取樣量，g。

2 結果與分析

2.1 測量不確定度來源分析

根據GB 5009.169—2016的第二法，分析了?；撬釞z測的基本流程。在建立了1.2.2的數學模型之后，通過分析數學模型中的各個參數，列出每個參數的不確定度來源。不確定度的主要來源分析見圖1，主要由如下3個因素構成。①樣品的重復性檢測（每個參數的重復性可合并統一計算）。②由標準物質引入，其中涉及標準物質本身的純度、標準物質的稱量定容和稀釋、校準曲線的配制和線性擬合。③由前處理過程中帶入，需要考慮設備的性能、穩定性、檢測環境因素等方面，包含了用于稱量試樣的電子天平、用于試樣定容的容量瓶的不確定度，以及回收率檢測結果引入的不確定度。

圖1 測量不確定度的來源分析圖

2.2 各分量的不確定度評定

2.2.1 試樣的重復測定結果引入的不確定度urel(rep)

對試樣進行10次的獨立重復性檢測，所得結果見表1。由于試樣的檢測過程能覆蓋整個方法的全過程，而且還能同時體現出稱量、定容等分量的重復性，因此可以采用A類評定的方法，統一對重復性的不確定度進行計算。

表1 ?；撬岬臏y定值表

10次獨立測量結果的平均值xˉ=39.4 mg/100 g。根據格拉布斯檢驗法，下側上側在檢出水平a=0.05時臨界值G1-0.05/2(10)=2.290，G＜G'＜G0.975(10)，沒有離群值。

多次（n=10）重復測定，計算得出標準偏差為日常檢測對被測樣品實際測量時，重復測量2次，即n'=2，因為儀器比較穩定、測量過程可控，因此重復性導致的A類標準不確定度為相對不確定度分量為

2.2.2 標準物質的配制過程引入的不確定度urel(ρ)

由標準物質的配制過程引入的不確定度主要來自標準物質本身的純度，還有標準物質的稱量和定容過程。

稱量過程使用電子天平，其不確定度主要來自于電子天平本身的偏載誤差、示值誤差和重復性。重復性已在之前樣品的測量結果重復性中考慮，因此不再重復計算。根據《電子天平檢定規程》（JJG 1036—2008），I級天平的偏載誤差要求在±1.0e之內，示值誤差要求在±0.5e之內[14]。實驗過程中使用天平的檢定證書顯示檢定結果合格。因此，由天平產生的標準不確定度分量使用B類評定。電子天平假設服從均勻分布，e=0.1 mg，偏載誤差的區間半寬度am1=0.1 mg，由此引入的標準不確定度為示值誤差的區間半寬度am2=0.05 mg，由此引入的標準不確定度為稱量過程的合成標準不確定度可合成為

牛磺酸實際稱量的質量為m=25.08 mg，這是通過2次測量相減得出的，所以相對標準不確定度為

標準品定容時使用25 mL容量瓶，定容過程會存在的不確定度主要有容量瓶本身的允差、實驗室環境溫度的變化和重復性[15]。按照《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 109—2006），A級容量瓶最大容量允差為±0.03 mL，容量瓶假設服從三角分布，引入的不確定度分量為X=（39.4±2.1）mg/100 g。容量瓶校準溫度為20 ℃，實驗室室內溫度在±4 ℃變動。環境溫度變動對體積的影響可以通過體積膨脹系數來計算。水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1，對體積測量所引入的不確定度分量為

根據標準物質證書中提供的數據，?；撬峒兌仁?9.9%，U=±0.6%（k=2），因此不確定度U=0.6%/2=0.3%，由純度引入的不確定度計算公式為

將3個分量合成，得到標準物質引入的不確定度分量為

2.2.3 標準物質配制校準曲線過程所引入的不確定度urel(s)

校準曲線的配制步驟中會用到不同規格的移液管和容量瓶，移液管和容量瓶的允差及實驗室環境溫度引起的體積變化會引入不確定度分量。

校準曲線的配制過程如下：分別使用0.25 mL、1.00 mL、5.00 mL和10.00 mL的吸量管移取0.25 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL和10.00 mL的標準儲備液于5個50 mL容量瓶中，得到?；撬峁ぷ髑€的濃度分別為0.5 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1。依據JJG 196—2006中的玻璃容器允差要求，吸量管假設為均勻分布計算，容量瓶假設為三角分布計算，結果見表2。

表2 校準曲線配制過程的不確定度評定表

由此得到校準曲線在配制過程引入的相對標準不確定度為

2.2.4 最小二乘法擬合校準曲線引入的不確定度urel(c)

通過最小二乘法得到的校準曲線計算樣品溶液中牛磺酸的含量。用標準儲備液配制出濃度依次為0 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1和20.00 μg·mL-1的標準工作點，通過最小二乘法擬合校準曲線時，計算得到的濃度c0的不確定度僅與峰面積的測量不確定度有關。對不同含量的標準工作溶液各測量2次，共計12次，結果見表3。

表3 不同濃度?；撬嵝嗜芤旱姆迕娣e響應值表

擬合校準曲線的方程為A=B1c+B0=11.91c-0.379 2。校準曲線擬合直線的殘差標準偏差為

對被測樣品測量2次，即p=2，測得樣品溶液的?；撬釢舛葹閏0=7.987 μg·mL-1，其標準不確定度及相對標準不確定度為

2.2.5 樣品前處理過程

由樣品前處理過程引入的不確定度主要來自試樣的稱量過程urel(m)、定容過程urel(V)和回收率urel(r)。

（1）稱量用電子天平的不確定度主要來自電子天平本身的偏載誤差、示值誤差和重復性。重復性已在之前的樣品測量結果重復性中考慮，因此不再重復計算。根據JJG 1036—2008，I級天平的偏載誤差要求在±1.0e之內，示值誤差要求在±0.5e之內。實驗過程中使用天平的檢定證書顯示，天平偏載誤差為-0.1 mg，示值誤差為0.0 mg，檢定合格。采用B類評定，電子天平一般假設服從均勻分布，e=1.0 mg，偏載誤差的區間半寬度am1=1.0 mg，標準不確定度為示值誤差的區間半寬度am2=0.5 mg，標準不確定度為SR。標準物質稱量的合成標準不確定度試樣質量m=2.038 1 g是通過兩次稱量相減得出的，所以試樣稱重過程的相對標準不確定度為

（2）樣品定容時使用100 mL容量瓶，定容的不確定度主要來自容量瓶允差、溫度變動以及重復性[15]。根據JJG 109—2006，A級容量瓶容量允差為±0.1 mL，假設服從三角分布，不確定度分量為容量瓶校準溫度是20 ℃，實驗室的環境溫度控制在±4 ℃。水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1，體積測量所引入的不確定度分 量 為將兩分量合成，得出定容的不確定度分量為相對標準不確定度為

（3）回收率結果如表4所示。對回收率的數據進行檢驗，理論上理想的回收率應為100%，因此可通過t檢驗法對實測回收率與理論回收率的差異進行顯著性分析。根據公式計算統計量t，在95%的置信水平下，顯著水平a=0.05，自由度為f=n-1=5（n=6），查雙尾t分布表得到臨界值ta(f)為2.571。t＞ta(f)，因此實測回收率與理論回收率有顯著性差異，需要通過回收率校正檢測結果。由回收率的結果引入的不確定度為相對標準不確定度為

表4 ?；撬峒訕嘶厥章时?/p>

2.3 合成相對標準不確定度的匯總

將以上的不確定度分量進行整理匯總，并列出各種分量的相對標準不確定度數據，結果如表5所示。

表5 ?；撬釡y量不確定度匯總表

從表5可以發現，7種不確定度分量對合成不確定度的貢獻程度有很大的不同，由大到小依次為urel(rep)＞urel(s)＞urel(r)＞urel(ρ)＞urel(c)＞urel(V)＞urel(m)，其中樣品的測量結果重復性urel(rep)、標準工作溶液的配制過程urel(s)的貢獻程度較大。

根據表5，?；撬岷繙y定的合成相對標準不確定度為

2.4 結果的表達

3 結論

依據國家標準GB 5009.169—2016的第二法測定奶粉中營養成分牛磺酸的含量，然后對測定結果的不確定度進行評定。當樣品中?；撬岬暮繛?9.4 mg/100 g時，擴展不確定度U=2.1 mg/100 g（k=2）。測定結果的不確定度分量中，7種不確定分量對合成不確定度的貢獻具有很大的差別，從大到小依次為urel(rep)＞urel(s)＞urel(r)＞urel(ρ)＞urel(c)＞urel(V)＞urel(m)。其中樣品的測量結果重復性urel(rep)、校準溶液的配制過程urel(s)的相對標準不確定度數值較大，因此這兩項引入的不確定度占比高，是本實驗?；撬峤Y果的合成不確定度的主要貢獻因子?？梢姴捎弥把苌?高效液相色譜法測定?；撬岷繒r，重復性和校準溶液配制過程是測定結果準確與否的關鍵。

在實際檢測分析中，可以通過加強培訓、提高檢測人員的熟練程度來減少重復性測量引入的不確定度；同時可采取使用精度高的量器、簡化校準溶液的配制步驟、增加校準溶液的測定次數等措施，規避或減少由這些步驟引入的不確定度，從而提高結果的準確性。得到方法的相對不確定度后，可以使用不確定度的結果來進行實驗室的質量控制。