復(fù)合益生菌固體飲料調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的研究

◎ 嚴(yán)建剛，姚康飛，郭亞娟，李 艷，袁 方，毛新亮

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400）

腸道被喻為人體的“第二大腦”，也是人體最大的消化器官，腸道疾病與人體健康息息相關(guān)[1]。腸道疾病以炎癥性腸病居多，它是一種非傳染性疾病，會(huì)引起腹瀉、腹痛、便血、嘔吐和營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀，嚴(yán)重時(shí)誘發(fā)結(jié)腸癌。美國(guó)華盛頓大學(xué)健康指標(biāo)和評(píng)估研究所聯(lián)合消化疾病研究所的統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，從1990年到2017年，全球炎癥性腸炎患病人數(shù)從370萬(wàn)人上升到680萬(wàn)人，增加了85.1%[2]。臨床研究表明，腸道菌群失調(diào)是腸道疾病重要激發(fā)因素之一，主要表現(xiàn)在有益菌群數(shù)量減少和有害菌群數(shù)量增多[3-4]。

益生菌是一類通過(guò)定植在人體內(nèi)，改變其菌群組成，并對(duì)其產(chǎn)生有益作用的活性微生物[5]。當(dāng)攝入一定數(shù)量益生菌后，能促進(jìn)腸道有益菌增殖，進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主腸道內(nèi)菌群。腸道菌群在宿主中參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解、調(diào)控代謝、維穩(wěn)免疫系統(tǒng)等多方面生理活動(dòng)[3]，從而影響炎癥反應(yīng)發(fā)生[6-7]。目前，市場(chǎng)上益生菌類食品主要添加乳桿菌和雙歧桿菌。乳雙歧桿菌HN019是一株從酸奶中分離得到的革蘭氏陽(yáng)性菌，具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、抗炎癥和調(diào)節(jié)免疫等功效[8]。鼠李糖乳桿菌HN001最初從干酪中分離出來(lái)，該菌株作為乳制品的一部分被應(yīng)用20多年，具有抵抗結(jié)腸炎癥、降低膽固醇以及調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[9-10]。嗜酸乳桿菌NCFM是一種從健康人體糞便中分離出來(lái)的菌，具有良好耐酸、耐膽鹽特性，在臨床實(shí)驗(yàn)中口服能改善功能性腸病患者腹脹[11]。

隨著健康意識(shí)的增強(qiáng)，人們疾病醫(yī)學(xué)的理念逐漸從治療轉(zhuǎn)向預(yù)防，因此從日常膳食補(bǔ)充劑出發(fā)尋求有效調(diào)理腸道菌群功能的食品以預(yù)防炎癥性腸病是健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。本文將嗜酸乳桿菌NCFM、鼠李糖乳桿菌HN001和乳雙歧桿菌HN019制備復(fù)合益生菌固體飲料，通過(guò)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）對(duì)小鼠糞便菌群進(jìn)行分析，以研究復(fù)合益生菌制劑對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為預(yù)防炎癥性腸病功能食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

復(fù)合益生菌固體飲料（完美億生菌固體飲料TM，不少于1×1010CFU·g-1活菌，成分：鼠李糖乳桿菌HN001、嗜酸乳桿菌NCFM、乳雙歧桿菌HN019、赤蘚糖醇、低聚果糖和藍(lán)莓粉），由完美（中國(guó)）有限公司提供。磷酸鹽緩沖液（0.01 mol·L-1，pH=7.2）和吐溫80由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)公司提供；伊紅美藍(lán)瓊脂由廣東環(huán)凱微生物公司提供；革蘭氏染色液試劑盒、BBL瓊脂、D-環(huán)絲氨酸和胰?-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂由青島高科園海博生物公司提供；LBs瓊脂、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂和檸檬酸鐵銨由北京陸橋技術(shù)公司提供。

酸鹽緩沖液（0.01 mol·L-1，pH=7.2）配制：磷酸氫二鈉2.58 g，磷酸二氫鈉0.44 g，用純凈水溶解并定容至1 L，115 ℃高壓殺菌20 min，冷卻至室溫備用。

培養(yǎng)基配制：按試劑盒說(shuō)明書配制，115 ℃高壓殺菌20 min，冷卻至室溫，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只雄性Balb/c小鼠（SPF級(jí)），體重范圍為20.5～22.4 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002；恒溫恒濕飼養(yǎng)，溫度為（23±2）℃，濕度為45%～60%。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PL2002電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）公司；BSC-1100ⅡA2-X生物安全柜，濟(jì)南鑫貝西生物公司；LDZM-80KCS蒸汽滅菌鍋，上海申安儀器公司；PYL-230電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市萊伯特瑞儀器公司；SPL-250培養(yǎng)箱，天津市萊伯特瑞儀器公司；BX43型生物顯微鏡+MD50型數(shù)碼成像系統(tǒng)，奧林巴斯（上海）公司；MS105DU電子分析天平，梅特勒-托利多中國(guó)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥方法

選用檢疫合格的雄性Balb/c小鼠40只，隨機(jī)分為4組，即空白對(duì)照組、復(fù)合益生菌固體飲料低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。復(fù)合益生菌固體飲料低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠每天分別灌胃0.33 g·(kg·bw)-1、0.67 g·(kg·bw)-1、1.00 g·(kg·bw)-1益生菌固體飲料。所有樣品用水溶解，并按20 mL·kg-1灌胃，空白對(duì)照組每天灌胃相同劑量純凈水，每日一次，連續(xù)灌胃30 d，并每天定時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，并監(jiān)測(cè)其攝食量。

1.2.2 小鼠腸道菌群檢測(cè)

給樣前、給樣第14 d后的第24 h及給樣第30 d后的第24 h，分別在無(wú)菌干燥環(huán)境下收集小鼠肛門新鮮糞便并稱重，保存置無(wú)菌離心管，隨后加入磷酸鹽緩沖液（0.01 mol·L-1，pH 7.2）稀釋振蕩，使糞便終濃度為0.01 g·mL-1，設(shè)定為10-1。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用磷酸鹽緩沖液對(duì)母液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇3個(gè)合適的稀釋度進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。雙歧桿菌培養(yǎng)：母液稀釋至10-4～10-6，接種在BBL瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h。乳桿菌培養(yǎng)：母液稀釋至10-4～10-6，接種在LBs培養(yǎng)基，置于37 ℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h；腸球菌：母液稀釋至10-1～10-3，接種在疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃有氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h；腸桿菌：母液稀釋至10-1～10-3，接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃有氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h；產(chǎn)氣莢膜梭菌：母液稀釋至10-1～10-3，接種于TSC瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h。依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）調(diào)節(jié)腸道菌群功能檢驗(yàn)方法，通過(guò)菌落形態(tài)比較、革蘭氏染色鏡檢等相應(yīng)方法鑒定，確定樣品生長(zhǎng)菌落為目標(biāo)菌后，計(jì)數(shù)并乘以稀釋倍數(shù)，以菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值（lgCFU·g-1）表示，并按結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響

由表1可知，在實(shí)驗(yàn)期間，所有小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、攝食、排泌等均未見(jiàn)明顯異常，體重緩慢增長(zhǎng)。與空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組小鼠平均體重在喂食復(fù)合益生菌固體飲料期間均未見(jiàn)異常。上述結(jié)果表明復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠的生長(zhǎng)無(wú)不良影響。

表1 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠體重的影響表（±s，n=10）

表1 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠體重的影響表（±s，n=10）

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2.2 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.2.1 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)的影響

由表2可知，干預(yù)前各組小鼠間糞便中腸桿菌菌落數(shù)均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；干預(yù)14 d后，與干預(yù)前相比，高劑量組小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)顯著減少（P＜0.05）。干預(yù)30 d后，與空白對(duì)照組相比，中劑量組小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與干預(yù)前相比，中劑量組小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)極顯著減少（P＜0.01）。整體而言，復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠腸桿菌菌落具有抑制作用。

表2 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

表2 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05；與同組干預(yù)前相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2.2 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)的影響

由表3可知，干預(yù)前各組小鼠間糞便中腸球菌菌落數(shù)均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與空白對(duì)照組相比，喂食30 d后，中劑量組小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)顯著減少（P＜0.05）。與干預(yù)前相比，干預(yù)14 d后低劑量組和高劑量組小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)均極顯著減少（P＜0.01），干預(yù)30 d后復(fù)合益生菌固體飲料所有組別小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)均顯著或極顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），該結(jié)果表明復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)腸球菌的定植具有阻抗作用。

表3 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

表3 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05；與同組干預(yù)前相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2.3 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)的影響

由表4可知，干預(yù)前各組小鼠間糞便中產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與空白對(duì)照組相比，各組小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)較干預(yù)前均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與同組干預(yù)前相比，干預(yù)30 d后高劑量組小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)顯著降低（P＜0.05），表明復(fù)合益生菌固體飲料具有減少產(chǎn)氣莢膜梭菌作用。

表4 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

表4 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

注：與同組干預(yù)前相比，#P＜0.05。

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2.2.4 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便乳桿菌菌落數(shù)的影響

由表5可知，干預(yù)前各組小鼠間糞便中乳桿菌菌落數(shù)無(wú)顯著差異；干預(yù)14 d后，與同組干預(yù)前相比，中劑量組小鼠糞便乳桿菌菌落數(shù)顯著增加（P＜0.05），表明復(fù)合益生菌固體飲料可增加乳桿菌的定植，對(duì)腸道微生物結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用。

表5 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便乳桿菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

表5 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便乳桿菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

注：與同組干預(yù)前相比，#P＜0.05。

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2.2.5 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)的影響

由表6可知，干預(yù)前各組小鼠間糞便雙歧桿菌菌落數(shù)均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；干預(yù)14 d后，與空白對(duì)照組相比，各給樣組小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；干預(yù)30 d后，與同組干預(yù)前相比，低劑量組小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)均顯著增加（P＜0.05），表明復(fù)合益生菌固體飲料可增殖腸道雙歧桿菌，增加腸道有益菌數(shù)量。

表6 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

表6 復(fù)合益生菌固體飲料對(duì)小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)的影響表（±s，n=10）

注：與同組干預(yù)前相比，#P＜0.05。

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3 結(jié)論與討論

胃腸道中存在龐大而復(fù)雜的微生物，是人類健康和疾病的重要決定因素。健康生理狀態(tài)下，腸道微生物處于平衡的共生生態(tài)系統(tǒng)中，可對(duì)食物中的營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)行分解、消化以及促進(jìn)吸收，保護(hù)腸道屏障防止病原體入侵，維持人體的正常功能。然而，這種平衡可能會(huì)被日常條件改變，如藥物使用或干擾腸道生理學(xué)的病理，產(chǎn)生不利于生物體的環(huán)境。當(dāng)腸道致病菌微生物占主導(dǎo)，會(huì)引發(fā)代謝功能紊亂，免疫力低下和器官病變。常見(jiàn)致病菌大多是腸桿菌和腸球菌，為革蘭氏陰性菌，在體內(nèi)產(chǎn)生毒素因子，破壞腸黏膜的完整性，引起炎癥性腸炎[12]等疾病。本研究結(jié)果顯示，小鼠食用復(fù)合益生菌固體飲料30 d后，中劑量組已可使糞便腸球菌和腸桿菌菌落數(shù)較食用前均明顯降低，并且腸球菌菌落數(shù)下降趨勢(shì)還呈現(xiàn)劑量遞增效應(yīng)，同時(shí)高劑量組小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)較食用前顯著減少。對(duì)于腸道有益菌，低劑量組小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)較食用前顯著增加。按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中調(diào)節(jié)腸道菌群功能檢驗(yàn)方法的要求進(jìn)行結(jié)果判定，復(fù)合益生菌固體飲料具有調(diào)節(jié)腸道菌群功能，可抑制致病菌生長(zhǎng)，促進(jìn)優(yōu)勢(shì)菌增殖。本文研究結(jié)果與郎春輝等[13]的報(bào)道基本一致，嗜酸乳桿菌NCFM和乳雙歧桿菌HN019聯(lián)用可抑制小鼠腸道致病菌數(shù)量，增強(qiáng)對(duì)外來(lái)有害微生物定植的阻抗力，對(duì)機(jī)體健康有保護(hù)作用。

益生菌抑制有害菌生長(zhǎng)主要存在以下3個(gè)方面的作用機(jī)制[14-15]。①與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點(diǎn)，抑制其在腸道組織的黏附和定植。②酵解腸道不易吸收食物，代謝短鏈脂肪酸，形成酸性微環(huán)境，抑制病原體生長(zhǎng)。③釋放抗菌肽，破壞病原菌細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。王韻婷等[16]研究結(jié)果也表明長(zhǎng)雙歧桿菌BB536聯(lián)合乳雙歧桿菌HN019益生菌制劑可提高乙酸、丙酸和丁酸3種短鏈脂肪酸含量，改善腸道微環(huán)境。此外，INTURRI等[17]使用瓊脂孔擴(kuò)散和肉湯微稀釋方法對(duì)益生菌抗菌活性進(jìn)行了體外研究，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌BB536和鼠李糖乳桿菌HN001對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和念珠菌具有抑制作用。綜上所述，本研究復(fù)合益生菌固體飲料可對(duì)小鼠腸道正向調(diào)節(jié)，增加有益菌的增殖，同時(shí)抑制有害菌生長(zhǎng)。本次研究進(jìn)一步探究了益生菌在腸道中的作用，為調(diào)理腸道菌群功能食品的開(kāi)發(fā)與研究提供幫助，但對(duì)其調(diào)節(jié)腸道菌群的機(jī)制尚未完全清楚，待進(jìn)一步探究。